论文摘要
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起,是目前造成世界范围内养猪业经济损失最为严重的传染病之一。RNAi技术最突出的优点是具有强大的抑制基因表达的效应和高度的序列特异性。慢病毒能够高效感染处于静止期和分裂期的细胞,这使得它成为实现长期基因表达的理想工具。本研究将慢病毒和RNAi技术相结合,从而为进一步抑制PRRSV感染提供新的思路。研究内容包括：1.在实验室先前工作的基础之上,将H1-shRNA表达框经PCR扩增后克隆至慢病毒载体质粒pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen,将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒分别与包装质粒、包膜质粒共转染293FT细胞,生产出表达针对PRRSV S1株ORF1b、ORF7 shRNA的重组慢病毒,分别命名rLV-P3和rLV-N3,测定其病毒滴度都约为1.0×107efu/mL.2.以PRRSV SY0608株ORF1基因为siRNA靶基因,设计合成5对具有小发夹结构的两条寡核酸序列,经退火形成互补双链,再克隆至慢病毒载体质粒pLVX-shRNA,将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒分别与Packaging Mixer共转染293FT细胞,生产出5种重组慢病毒,分别命名为rLV-NP1, rLV-NP2, rLV-NP7, rLV-NP9,rLV-NP11,测定其病毒滴度都达到5×105IFU/mL左右。3.将rLV-NP9以一定剂量感染Marc-145细胞,培养48h后经过流式细胞仪筛选,无菌分离出表达绿色荧光蛋白的细胞。将分离出的细胞扩大培养,细胞形态稳定,并且可以正常传代。提取细胞基因组进行PCR鉴定,建立了表达靶向PRRSV SY0608株ORF1 shRNA的Marc-145细胞系,将此细胞系命名为shRNAEGFP-Marc-145细胞。4.将PRRSV SY0608株以一定剂量接种shRNAEGFP-Marc-145细胞和正常Marc-145细胞,48h后首先观察细胞病变（CPE）,同时测定细胞上清中的TCID50,并用荧光定量PCR法（Real-time PCR）测定病毒mRNA的含量。结果显示PRRSV SY0608株在这两种细胞系上形成的CPE没有明显差异,同时细胞上清中病毒的TCID50和mRNA含量也没有明显差异,说明shRNAEGFP-Marc-145细胞系不能够显著抑制PRRSVSY0608株的复制。