利用免疫学技术对三种赤潮藻的定性和定量研究

论文摘要

及时、精确预报赤潮的发生和快速、准确地对赤潮藻进行定性、定量分析成为当今赤潮研究的主要方向之一,但是通过现有的检测手段还不能完全准确的预报赤潮的发生,特别是快速、准确的定性、定量检测赤潮藻。本研究选取我国近海三种不同粒径的赤潮藻—赤潮异弯藻、共生甲藻、链状亚历山大藻为研究对象,通过免疫家兔制备了它们的多克隆抗体,对多克隆抗体进行效价测定,以反映抗血清中抗海藻IgG分子数目的多少和它们与相应海藻细胞结合能力的大小,同时对比不同形态大小的藻细胞抗体效价的差异和规律。对所获得抗血清的特异性进行了鉴定,并采用吸附封闭处理的方法提高抗体的特异性。结果表明未经吸附处理的赤潮异弯藻、共生甲藻效价分别达到1:41 000、1:18 000以上,显示是高亲合力的抗体;链状亚历山大藻抗体效价达到1:3 500,相比另两种藻的效价较低;吸附处理后的三种多克隆抗体的特异性明显提高,而效价有所下降。三种多克隆抗体与各自藻细胞均有很强的结合力。竞争酶联免疫法对藻细胞的检测表明制备的多克隆抗体与其他种类藻细胞交叉反应较弱,特异性较好。采用间接荧光免疫显微检测技术对赤潮藻细胞表面抗原分布,以及多克隆抗体的特异性进行了更加直观的研究,结合流式细胞仪分析,快速定性、定量地检测样品中的藻细胞。结果表明三种多克隆抗体与各自藻细胞均有很强的结合力,赤潮异弯藻和共生甲藻的荧光信号均匀分布于细胞表面,链状亚历山大藻细胞的荧光信号在细胞表面分布不均匀,主要集中在腹部横沟内。制备的多克隆抗体只与自身藻细胞结合,与另外两种藻细胞无交叉反应。链状亚历山大藻抗体只与自身藻细胞结合,与塔马亚历山大藻无交叉反应,可作为同属内不同种的鉴别。利用流式细胞术检测表明该方法通过激发荧光光谱范围的不同可以区分荧光标记的藻细胞,在定量方面与显微镜观察计数存在一定差异,赤潮异弯藻镜检结果同流式检测结果的差异为+5.16%,共生甲藻镜检结果同流式检测结果的差异为+4.65%,链状亚历山大藻镜检结果同流式检测结果的差异为+11.76%,可能是多克隆抗体与藻细胞结合率以及荧光标记二抗与多克隆抗体的结合率的影响有关,造成显微计数结果偏大。该方法具有检测快、灵敏度高、结果稳定,不需要大量的形态分类学知识就可对某一特定的赤潮藻进行定性、定量分析;利用免疫流式细胞术的检测过程中,藻细胞的固定、标记、洗脱容易导致细胞丢失,如果通过多次回收、富集的方法可以尽量的减少细胞的丢失。采用rProtein G亲和纯化多克隆抗体,采用NHS标记法将抗体标记到羧基化磁珠表面,获得免疫磁珠。免疫磁珠与细胞表面相应分子特异性结合,或者已包被二抗（羊抗小鼠或羊抗大鼠）的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上,实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离,利用免疫磁珠分选方法对赤潮异弯藻进行定性、定量研究,结果表明免疫磁珠分离赤潮异弯藻细胞纯度可达85%--95%,得率在60%--90%左右,可进行特定藻细胞的分离和富集,还可进行活细胞的分选,方法简便、操作灵活。实验过程中洗脱的时间、强度会影响到研究的结果,造成存在交叉反应的假象,因此需要试验条件进行优化。此外,过低的浓度会影响结果的准确率。本文还探索了利用噬菌体表面展示肽库技术筛选针对赤潮异弯藻的特异多肽。通过筛选特异结合的多肽,研究赤潮异弯藻细胞表面抗原位点,用于分离检测赤潮异弯藻,为赤潮爆发的前期检测提供有效的手段。实验结果表明,筛选得到的针对赤潮异弯藻细胞的特异性多肽与其他藻细胞存在一定的交叉反应。造成结果的原因一方面可能是藻细胞中存在细菌等微生物,不能获得只针对藻细胞表面抗原的外源多肽。另一方面可能是噬菌体多肽的长度太短,不能与藻细胞表面抗原发生特异性结合,导致交叉反应存在。因此,在今后的研究中一方面需要获得纯化藻细胞,去除细菌等微生物的影响,另一方面采用更长的噬菌体展示肽库进行筛选,从而获得特异性更高的外源性多肽。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 0.1 赤潮的成因及危害
• 0.2 中国赤潮概述
• 0.3 定性及定量检测赤潮藻的主要技术和方法
• 0.3.1 基于形态学特征的检测方法
• 0.3.2 基于核酸探针的检测技术
• 0.3.3 荧光图像检测法
• 0.3.4 赤潮卫星遥感探测技术
• 0.3.5 基于免疫学方法检测
• 0.4 免疫学方法在有害藻检测中的应用
• 0.4.1 酶联免疫分析技术
• 0.4.2 免疫荧光检测
• 0.4.3 单克隆抗体检测方法
• 0.4.4 免疫传感技术
• 0.4.5 免疫磁性微粒检测
• 0.4.6 免疫流式细胞术
• 0.4.7 应用噬菌体展示肽库筛选特异多肽
• 0.5 研究课题的提出及立项依据
• 1 三种赤潮藻多克隆抗体的制备及酶联免疫检测
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 讨论
• 2. 间接荧光免疫显微检测
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 3. 利用免疫流式细胞术对赤潮藻的检测
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 4. 免疫磁珠法对赤潮异弯藻的检测
• 4.1 引言
• 4.2 实验原理
• 4.3 材料与方法
• 4.4 实验结果
• 4.5 讨论
• 5 噬菌体表面展示肽库技术筛选特异多肽
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.3 实验结果
• 5.4 讨论
• 参考文献
• 致谢