马铃薯X病毒和烟草脉带花叶病毒的分子变异及协生作用

论文摘要

马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）是危害烟草的一种常见病毒,单独侵染造成的危害较轻,而当与马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒复合侵染时则使症状加重并造成严重损失。烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV）属于Potyvirus,近几年在我国烟草上的发生有上升和蔓延的趋势。本研究分别测定了PVX和TVBMV的全基因组序列,分析了二者复合侵染对烟草植株生长和光合作用的影响以及辅助成分-蛋白酶（helper component-proteinase,HC-Pro）定点突变对PVX/HC-Pro协生作用的影响。最后,对病毒病害的生物防治进行了初步研究。根据GenBank已发表的PVX全基因组序列,设计简并和特异引物,克隆并测定了我国PVX-FX21和PVX-1985两个分离物的全基因组序列,这是我国大陆第一次扩增得到PVX分离物全基因组序列。两个分离物的基因组全长均为6435 bp ,3′-末端具poly（A）,包含5个开放阅读框（open reading frames,ORFs）。基因组全序列分析表明,PVX-FX21和PVX-1985均与欧亚组9个分离物一致率较高,而与美洲组4个分离物一致率较低。系统进化分析与一致率分析的结果一致,说明PVX的分布表现一定的地域性。基于衣壳蛋白（CP）序列的系统进化分析表明,38个PVX分离物分为两个大组:组I和组II,PVX-FX21和PVX-1985位于组I。PVX-FX21与荷兰X3分离物（D00344）的一致率最高（核苷酸一致率为96.9 %,氨基酸一致率为100 %）,而PVX-1985与英国的2个分离物Roth1、XS聚为一簇（核苷酸一致率分别为97.6%、97.3%,氨基酸一致率均为97.5%）。遗传多样性分析表明,不同地理来源的PVX种群所受的选择压力没有显著差别;全基因组5个开放阅读框均处于负向或纯化选择,其中RdRp所受的选择压力最大;进一步分析显示RdRp中间编码区在进化过程中处于正向或多样化选择。利用针对马铃薯Y病毒属病毒的简并或特异引物,通过RT-PCR的方法扩增得到TVBMV云南分离物YND的全基因组序列。除了3′-端poly（A）外,YND基因组全序列包括9570个核苷酸,含有一个大的开放阅读框,编码一个由3079个氨基酸组成的多聚蛋白,分子量约为348.6 kDa。全基因组序列系统进化分析表明,TVBMV是Potyvirus中一个独立的种。TVBMV-YND分离物基因组不同部分与Potyvirus其它病毒相应部分有不同的一致率水平,然而,多数部分与南美红辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）一致率最高。比较特别的是,该分离物的NIb/CP切割位点为Q/N,这在马铃薯Y病毒属病毒中非常少见。另外,HC-Pro中含有比较罕见的参与蚜传的RITC基序。本研究通过接种试验证明TVBMV与PVX复合侵染烟草表现出协生作用。在供试的三生烟和普通烟上,二者复合侵染不但使病害症状加重,而且能显著抑制烟草植株的生长,并使光合作用下降。在本氏烟上,二者复合侵染甚至导致植株的死亡。但与以往研究不同的是,两种病毒在烟草植株体内的浓度都没有显著增加。利用基因定点突变技术获得了PVX-（HC-Pro）的12个突变体,应用反向遗传学技术证明HC-Pro的锌指结构、糖基化位点等多个保守基序中单个氨基酸的缺失或替换能影响其协生作用。而参与蚜传的KITC基序中K突变成A以后,并不影响其协生功能。本研究在大田作物和蔬菜根际共分离得到295个根际细菌菌株,通过对峙培养初筛、温室盆栽复筛得到一株对多种植物病原菌有较好拮抗活性的PGPR菌株Lyc2。温室盆栽试验表明,Lyc2对棉花立枯病的防治效果达到48.8%;水培棉花苗试验表明,Lyc2能显著增加棉苗的鲜重和干重,但对株高的影响不显著。TMV枯斑寄主接种试验证明,Lyc2菌悬液处理的三生烟不但枯斑数量明显减少而且枯斑的直径明显比对照小。大田试验结果表明,Lyc2处理对株高的促进作用较明显,但对茎粗及叶面积几乎没有什么影响,对病毒病的防效为33.7%。该菌经形态、生理生化试验测定及16S rDNA和ITS序列分析,初步确定为洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）;进一步通过种特异的recA基因序列分析,证明Lyc2菌株属于B. cepacia复合物中基因型IX,B. pyrrocinia。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 一、马铃薯X 病毒的研究进展
• 1. 生物学和血清学
• 1.1 病毒的发生与分布
• 1.2 传播方式与寄主范围
• 1.3 血清学
• 2. PVX 基因组结构与功能
• 2.1 PVX 5′-末端非翻译区（Untranslational region，5′-UTR）
• 2.2 RNA 依赖的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）
• 2.3 三基因块（Triple-gene block，TGB）
• 2.4 衣壳蛋白（Coat protein，CP）
• 2.5 3′-末端非翻译区（3′-UTR）
• 3. 株系划分情况
• 4. PVX 作为表达载体的应用
• 5. PVX 与马铃薯Y 病毒属病毒的协生作用
• 二、植物病毒的遗传变异
• 1. 植物病毒变异机制
• 2. 植物病毒准种的遗传变异
• 三、植物根际促生菌的研究进展
• 1. 根际细菌
• 2. PGPR 的根部定殖
• 3. PGPR 的作用机理
• 3.1 PGPR 的促生机制
• 3.2 PGPR 的防病机制
• 4. PGPR 菌株对植物病毒病的防治作用
• 四、本研究的目的意义
• 第二章 马铃薯X 病毒2 个中国分离物全基因组序列测定及分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 鉴别寄主
• 1.1.2 病毒的纯化
• 1.1.3 菌株和质粒
• 1.1.4 生化及分子生物学试剂
• 1.1.5 寡聚核苷酸引物
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 寄主范围测定
• 1.2.2 PVX 分离物的全基因组序列测定及分析
• 1.2.3 PVX-FX21 分离物CP 基因的克隆与原核表达
• 2. 结果与分析
• 2.1 PVX-FX21 的生物学特性测定与全基因组序列分析
• 2.1.1 生物学特性
• 2.1.2 PCR 扩增结果
• 2.1.3 PVX-FX21 的基因组结构及保守基序
• 2.2 马铃薯X 病毒的分子变异分析
• 2.2.1 PVX-1985 与PVX-FX21 序列比较与分析
• 2.2.2 马铃薯X 病毒基因组变异分析
• 2.2.3 PVX 抗血清制备
• 2.2.3.1 RT-PCR PVX CP 扩增基因
• 2.2.3.2 外源DNA 与质粒载体的连接及重组质粒的转化
• 2.2.3.3 大肠杆菌表达载体的构建
• 2.2.3.4 SDS-PAGE 分析
• 2.2.3.5 抗血清制备
• 2.2.3.6 病毒样品的血清学检测
• 3. 结论与讨论
• 第三章 烟草脉带花叶病毒全基因组序列测定与结构分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 毒原的纯化与保存
• 1.1.2 鉴别寄主
• 1.1.3 蚜虫
• 1.1.4 菌株和质粒
• 1.1.5 生化及分子生物学试剂
• 1.1.6 寡聚核苷酸引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 毒原的纯化
• 1.2.2 寄主范围测定
• 1.2.3 蚜虫传毒试验
• 1.2.4 植物总RNA 的提取
• 1.2.5 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 1.2.6 PCR 产物的纯化
• 1.2.7 连接反应
• 1.2.8 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 1.2.9 碱裂解法提取质粒DNA
• 1.2.10 PCR 鉴定
• 1.2.11 序列测定、拼接及系统分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 生物学特性
• 2.2 蚜虫传毒
• 2.3 TVBMV-YND 基因组结构及序列分析
• 2.4 一致率分析
• 2.5 系统进化分析
• 3. 结论与讨论
• 第四章 马铃薯X 病毒与烟草脉带花叶病毒协生作用研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 病毒的接种与叶片中病毒浓度的检测
• 1.2.2 烟株生长情况测定
• 1.2.3 烟草光合参数测定
• 1.2.4 HC-Pro 中参与协生的氨基酸位点分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 PVX 和TVBMV 单独侵染和复合侵染在不同烟草品种上的症状
• 2.2 病毒复合侵染对烟草株高和叶面积的影响
• 2.3 受两种病毒复合侵染的烟草叶片中病毒浓度的变化
• 2.4 病毒复合侵染对烟草叶片光合作用的影响
• 2.4.1 病毒复合侵染对烟草叶片光合速率的影响
• 2.4.2 病毒复合侵染对烟草叶片蒸腾速率的影响
• 2.4.3 病毒复合侵染对烟草叶片气孔导度的影响
• 2 浓度的影响'>2.4.4 病毒复合侵染对烟草叶片胞间 CO₂浓度的影响
• 2.5 HC-Pro 定点突变对协生作用的影响
• 3. 结论与讨论
• 第五章 PGPR 菌株的筛选、鉴定及生防作用
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试病原菌
• 1.1.2 供试植株
• 1.1.3 分离和培养用培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 根际细菌的分离、筛选
• 1.2.2 菌株Lyc2 对棉花立枯病的防病效果
• 1.2.3 菌株Lyc2 对棉苗的促生作用
• 1.2.4 致病性测定
• 1.2.5 菌株Lyc2 对烟草病毒病的室内及田间抑制作用
• 1.2.6 菌株Lyc2 的生理生化及分子鉴定
• 2. 结果与分析
• 2.1 根际细菌的分离和筛选
• 2.2 对5 个菌株的抑菌谱测定
• 2.3 致病性测定
• 2.4 菌株Lyc2 对棉花立枯病的盆栽防病效果
• 2.5 菌株Lyc2 对棉苗的促生作用
• 2.6 菌株Lyc2 对烟草病毒病的防治效果
• 2.6.1 PGPR 菌悬液喷施处理对三生烟上TMV 枯斑数量的影响
• 2.6.2 PGPR 菌株对田间烟草病毒病的防病效果
• 2.6.3 PGPR 处理对烟草植株生长的影响
• 2.7 菌株Lyc2 的鉴定
• 2.7.1 形态和培养特征
• 2.7.2 生理生化特征
• 2.7.3 16S rDNA 及 16S-23S rDNA ITS PCR 扩增、序列测定和分析
• 2.7.4 基于recA 基因的PCR 扩增和序列分析
• 3. 结论与讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表论文情况