双瓣茉莉花HPL与GDS基因的克隆与分析

论文摘要

茉莉花[Jasminum sambac （Linn.） Aiton]是香料工业与制茶业重要的原材料，是香味物质重要的植物资源。形成花朵香气的挥发性分子大都是一类低分子量、低沸点、低极性的化合物。本研究以采自福建农林大学的双瓣茉莉花的叶片和花蕾为材料，利用RT-PCR以及RACE技术获得脂肪酸过氧化氢酶（fatty acid hydroperoxide lyase,HPL）和香叶烯D合酶（germacrene D synthase, GDS）基因cDNA，并用半定量RT-PCR分析HPL和GDS在嫩叶和花蕾不同时期的表达水平，对茉莉花香气合成有关酶的基因进行克隆与分析。1克隆茉莉花HPL基因cDNA全长并利用半定量RT-PCR进行分析利用已登录GenBank的HPL基因，设计简并引物对保守片段进行扩增，通过RACE技术获得5ˊ和3ˊ序列，从而获得含1479bpORF的1703bpHPL基因全长，492个氨基酸，预测其相对分子量为55372.8，等电点为8.39，5ˊ端有80bp非编码区，3ˊ端包含134bp非编码序列；根据cDNA全长推导氨基酸序列与橄榄、番茄、马铃薯等植物HPL基因的氨基酸序列进行同源性对比分析并构建进化树。以茉莉花Actin基因为阳性对照，检测茉莉花HPL基因在嫩芽、花蕾1-3期、开花期的表达水平。结果表明茉莉花HPL基因在这5个时期内均有表达，且表达量遵循HPL在花发育时期高表达，花成熟后表达量降低以及老叶表达量低于新叶的发育特异性。2克隆茉莉花GDS基因cDNA全长并利用半定量RT-PCR进行分析利用已登录GenBank的GDS基因，设计针对保守区的简并引物，获得保守片段，通过RACE技术获得5ˊ和3ˊ序列，从而获得含1674bp ORF的1863bp GDS基因全长，552个氨基酸，预测其相对分子量为64016.4，等电点为5.26，5ˊ端有90bp非编码区，3ˊ端包含104bp非编码序列；根据cDNA全长推导氨基酸序列与罗勒、猕猴桃、葡萄等植物GDS基因的氨基酸序列进行同源性对比分析并构建进化树。以茉莉花Actin基因为阳性对照，检测茉莉花GDS基因在嫩芽、花蕾1-3期、开花期的表达水平。结果表明茉莉花GDS基因只在花蕾3期和开花期有表达，符合“往往在特定器官、组织和发育阶段表达”，同时也为“气质花”一说提供基因角度上的支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词对照表
• 第一章 前言
• 1 研究背景
• 2 文献综述
• 2.1 花卉香味物质的种类及合成途径
• 2.2 茉莉花香味物质与释香机制研究进展
• 2.3 国内外植物香味基因工程研究进展
• 3 脂肪酸过氧化氢酶（fatty acid hydroperoxide lyase, HPL）
• 4 香叶烯 D 合酶（germacrene D synthase, GDS）
• 5 RACE 技术在植物基因克隆上的应用
• 6 研究意义与技术路线
• 6.1 研究意义
• 6.2 研究内容
• 6.3 技术路线
• 第二章 茉莉花总 RNA 的提取和 cDNA 的合成
• 1 试验材料与仪器
• 1.1 材料
• 1.2 试剂与仪器
• 2 试验方法
• 2.1 茉莉花总 RNA 的提取与测验
• 2.2 cDNA 第一链的合成
• 2.3 5ˊ-RACE-Ready cDNA 第一链的合成
• 3 结果与分析
• 3.1 茉莉花花蕾期和开花期的确定
• 3.2 茉莉花花瓣总 RNA 的提取
• 4 讨论
• 第三章 茉莉花 HPL 基因克隆与半定量 RT-PCR 分析
• 1 试验材料与仪器
• 1.1 材料
• 1.2 试剂与仪器
• 2 试验方法
• 2.1 利用 RT-PCR 获得茉莉花 HPL 基因保守片段
• 2.2 HPL 基因 3ˊ-RACE
• 2.3 HPL 基因 5ˊ-RACE
• 2.4 开放放阅读框（ORF）
• 2.5 HPL 基因半定量 RT-PCR 分析
• 3 结果与分析
• 3.1 HPL 基因引物的设计
• 3.2 PCR 扩增程序与反应体系的优化
• 3.3 HPL 基因克隆与分析
• 3.4 HPL 基因半定量 RT-PCR 分析
• 4 讨论
• 第四章 茉莉花 GDS 基因克隆与半定量 RT-PCR 分析
• 1 试验材料与仪器
• 2 试验方法
• 2.1 利用 RT-PCR 获得茉莉花 HPL 基因保守片段
• 2.2 GDS 基因 3ˊ-RACE
• 2.3 GDS 基因 5ˊ-RACE
• 2.4 开放放阅读框（ORF）
• 2.5 GDS 基因半定量 RT-PCR 分析
• 3 结果与分析
• 3.1 GDS 基因引物的设计
• 3.2 GDS 基因克隆与分析
• 3.3 GDS 基因半定量 RT-PCR 分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢