论文摘要
目的:胃癌是我国的常见恶性肿瘤之一。胃癌存在细胞凋亡明显受阻现象。Survivin是IAP家族的成员,具有较强抑制凋亡功能。Survivin在胎儿组织中大量表达,然而在正常的分化成熟的组织中无表达。Survivin同时也在大量恶性肿瘤组织中过度表达。已有研究证实Survivin的表达水平与胃癌凋亡指数呈负相关关系,但其在胃癌中的作用、作用机制以及其临床意义较少文献报告。信号转导子和转录活化子1（signal transducer and activator of transcription 1, STAT1）是新近发现的具有信号传导和转录调控双重功能的细胞凋亡促进因子。STAT1在胃癌组织中的表达情况、胃癌中的作用、作用机制以及其临床意义尚未发现文献报告。我们推测两者有可能通过相同的调控点调控凋亡,两者之间可能存在相关性。该方面研究尚未发现文献报告。淋巴结转移是胃癌预后中重要指标,而胃癌手术标本的淋巴结检查数量不足将影响淋巴结检查结果的准确性。AJCC/UICC推荐胃癌淋巴结检查数应≥15枚。当前胃癌淋巴结的检查较少能达到这一标准,而获取全数淋巴结的就更少,由此而获得的研究结论缺乏一定的科学性和准确性。本研究并首次提出STAT1和Survivin存在相关性的推测,拟通过通过组织芯片和免疫组织化学的方法,首次在有完整淋巴结检查数据和有完整临床病理学检查资料的胃腺癌组织中,观察STAT1和Survivin及其相关蛋白在人胃腺癌组织中表达的情况,研究STAT1和Survivin及其相关蛋白表达与人胃腺癌临床病理学指标之间的关系以及各蛋白表达之间的相关性,探讨STAT1和Survivin的临床意义,两者在胃腺癌凋亡调控中可能存在的路径以及两者的相关性。在人胃腺癌组织中初步探讨了STAT1和Survivin的相关性后,选用人胃癌细胞株SGC7901,分别和/或同时使用IFN-γ、不同浓度的STAT1反义寡核苷酸和不同浓度的Survivin反义寡核苷酸处理细胞,通过免疫细胞化学的方法和图像分析的方法观察在STAT1和Survivin表达水平改变的情况下,两者及其相关蛋白的表达变化;同时进行Hoechest33258染色观察细胞凋亡的变化。进一步探询STAT1与Survivin在胃癌中的作用、可能存在的机制以及两者之间的相互关系,探讨STAT1在胃癌凋亡调控中可能存在的分子通路,本研究可望为探讨胃癌肿瘤细胞凋亡的机制提供重要的实验依据,进而为胃癌个体化治疗提供新的思路和干预靶点。方法:收集1989～2001年江汉大学附属医院行胃腺癌手术标本140例进行临床病理学研究,选用胃癌细胞系SGC7901进行细胞生物学研究。胃腺癌手术标本经过溶脂法检查获取全数淋巴结,行4μm间断连续切片、常规HE染色和CK18+EMA免疫组化染色以获取完整的淋巴结检查资料,同时收集完整的病理学检查资料。通过电话形式随访,所有随访者至少接受一次胃镜检查进行临床复查。建立胃癌组织芯片,经免疫组织化学染色方法检查胃癌原发灶中STAT1、Survivin、caspase3、caspase7、p53和PTEN等蛋白表达的情况。全部数据均经SAS 8.1统计学软件进行分析处理,各分子指标之间以及与临床病理学指标之间的相关性通过卡方检验、spearman等级相关及精确概率法分析;生存曲线通过life-table法进行绘制,各分子指标和病理学指标与生存之间的关系通过Cox模型回归分析。在SGC7901胃癌细胞中,分别和/或同时使用IFN-γ、不同浓度的STAT1反义寡核苷酸和不同浓度的Survivin反义寡核苷酸处理细胞,通过免疫细胞化学染色和平均光密度分析,观察STAT1、Survivin以及相关凋亡调节因子caspase7和p21WAF在蛋白水平的表达变化。通过Hoechest33258染色,在高倍镜下观察细胞亮度及形态学变化以检测凋亡,并随机数取1000个细胞进行凋亡细胞记数。数据均经SAS 8.1统计学软件进行分析处理,平均光密度值之间的差异通过t检验分析。结果:1. 140例胃腺癌制成288点组织芯片一枚。经免疫组织化学染色及结果判读,组织芯片平均利用率为83.3%。各分子指标之间关系如下:Survivin和STAT1（χ2=4.11,P=0.043）、caspase3（χ2=5.76,P=0.02）负相关,与PTEN（χ2=4.17,P=0.04）正相关;STAT1和caspase3（χ2=13.33,P<0.001）、caspase7（χ2=5.84,P=0.016）正相关;caspase3和caspase7正相关（χ2=23.98,P<0.001）;p53和PTEN正相关（P=0.048）。2. 140例胃腺癌中,男性99例,女性41例（构成比分别是71%和29%）。年龄26～72岁,中位年龄58岁。肿块大小0.8～15cm,中位大小5.4cm。浸润深度按照UICC分期,T1:16例,T2:22例,T3:45例,T4:57例。高分化型腺癌52例,低分化型腺癌88例。有异质性胃腺癌84例,无异质性胃腺癌56例。共获取淋巴结共8892枚,63.5枚/例（17～157枚,中位数:61枚,95%CI:59-68）。其中102例存在淋巴结转移,共检出转移淋巴结1824枚（1824/8892,20.5%）。按照AJCC/UICC淋巴结分期标准,N0期38例,N1期34例,N2期30例,N3期38例。各分子指标与病理学指标关系如下:UICC淋巴结分期: Survivin表达阳性率与UICC淋巴结分期负相关（P=0.04）。其他分子指标与UICC淋巴结分期无关。浸润深度: STAT1表达阳性率（r=-0.21,P=0.03）与浸润深度负相关;PTEN表达阳性率（P=0.02）与浸润深度正相关。其他分子指标与浸润深度无关。组织学分型: Survivin在高分化型腺癌中表达阳性率高于低分化型腺癌中表达阳性率,有显著性差异（χ2=4.83,P=0.03）。STAT1在高分化型腺癌中表达阳性率低于低分化型腺癌中表达阳性率,有显著性差异（χ2=10.2,P=0.0001）。p53在高分化型腺癌中表达阳性率低于低分化型腺癌中表达阳性率（χ2=7.21,P=0.007）。PTEN在高分化型腺癌中表达阳性率高于低分化型腺癌中表达阳性率（χ2=5.47,P=0.02）。其他分子指标与组织学分型无关。异质性: caspase3在有异质性胃癌中表达阳性率高于无异质性胃癌中表达阳性率,有显著性差异（χ2=7.36,P=0.007）。其他分子指标与异质性无关。年龄: p53在<60岁年龄组表达阳性率低于≥60岁年龄组表达阳性率,有显著性差异（χ2=7.20,P=0.007）。PTEN在<60岁年龄组中表达阳性率低于≥60岁年龄组中表达阳性率（χ2=4.37,P=0.04）。其他分子指标与年龄无关。性别:各分子指标与性别均无关。3.通过电话及临床复查形式随访病例共110例,随访时间截至于2005年7月,所有随访者至少接受过一次胃镜检查。胃癌浸润深度（χ2=7.26,P=0.007）以及UICC淋巴结分期（χ2=4.01,P=0.045）与生存时间有关。其他分子指标和病理学指标与生存无关。4.在IFN-γ刺激SGC7901胃癌细胞时,STAT1、caspase7和p21WAF表达水平明显上调（P<0.05） ;Survivin表达水平明显下调（P<0.05）。在IFN-γ刺激SGC7901胃癌细胞的同时,使用不同浓度的STAT1反义寡核苷酸抑制STAT1的表达,STAT1、caspase7和p21WAF表达水平出现不同程度的下调（均P<0.05）;Survivin表达水平出现不同程度的上调（P<0.05）。5.在使用不同浓度的Survivin反义寡核苷酸抑制Survivin的表达时,Survivin表达量出现不同程度的降低（P<0.05）;STAT1表达水平出现上调（P<0.05）;caspase7和p21WAF表达水平无明显变化（P>0.05）。6.胃癌SGC7901细胞株在各处理组中,凋亡无明显变化（P>0.05）。结论:1、胃腺癌组织中,STAT1表达与caspase3、7表达正相关。Survivin表达与caspase3表达正相关。STAT1表达与Survivin表达负相关。提示胃腺癌组织中STAT1和Survivin均可通过caspase3等凋亡调节点发挥其生物学作用,而STAT1和Survivin之间存在相关性。2、STAT1和Survivin在胃癌发展的过程中发挥重要作用。STAT1蛋白表达是推测进展期胃癌的分子标志物。Survivin蛋白表达是推测胃癌淋巴结转移及转移程度的分子标志物。3、Survivin表达阳性率与UICC淋巴结分期负相关,在高分化型腺癌中表达阳性率高;STAT1表达阳性率与浸润深度负相关,在高分化型腺癌中表达阳性率低。在不同恶性程度的胃癌组织中,凋亡调节蛋白STAT1和Survivin表达水平的变化,提示胃癌恶性程度越高,其凋亡水平可能越高。4、胃腺癌中,按照淋巴结转移数目进行的分期和浸润深度是重要的预后指标。5、胃癌细胞系SGC7901中,STAT1的上调可促进caspase7和p21WAF表达的上调。进一步证实胃癌细胞中STAT1可通过对caspase7和p21WAF表达的调控发挥其生物学作用。Survivin表达量的改变未引起caspase7和p21WAF表达量的变化。提示Survivin并不能通过对caspase7和p21WAF的转录调节发挥其生物学作用,该结果与文献报告Survivin通过与caspase7和p21WAF结合而发挥抑制凋亡作用的机制一致。6、在分别改变胃癌细胞系SGC7901中STAT1和Survivin表达量的时候,两者表达水平负相关,提示胃癌细胞中STAT1发挥促凋亡作用的调节点,不仅包括caspase3、caspase7和p21WAF还可能包括Survivin。该现象为我们首次发现。7、胃癌SGC7901细胞株在各处理组中,凋亡无明显变化,提示SGC7901细胞中可能存在多条凋亡调控途径。
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