小鼠卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育过程中RCC1的表达及定位

论文摘要

RCC1(Regulator of chromosome condensation)是目前唯一已知的Ran鸟嘌呤核苷酸交换因子。RCC1作为细胞周期调节因子在许多有机体的细胞中发挥作用。RCC1调节RanGDP到RanGTP的转换,在核内输、外运,有丝分裂期纺锤体的形成及核膜的重组,防止S期DNA多重复制等过程中发挥作用。在本实验中,首先用巢式PCR检测RCC1在小鼠GV期卵母细胞和早期胚胎中的表达情况。发现GV期卵母细胞到受精后的二细胞、四细胞、八细胞期,桑葚胚及囊胚的胚胎细胞中,RCC1 mRNA的表达量逐渐升高。之后用激光共聚焦显微技术分别检测了小鼠卵母细胞减数分裂成熟、受精和早期胚胎有丝分裂过程中RCC1的定位,发现RCC1主要位于卵母细胞、合子和早期胚胎细胞的间期细胞核内,核仁中没有RCC1分布,细胞质中微量分布;卵母细胞核膜破裂后,RCC1分布到整个细胞,在细胞质中分布均匀,未见RCC1在染色体周围浓集;减数分裂的后期和末期染色体分离后,RCC1在细胞质中分布亦比较均匀,未见RCC1在染色体周围浓集。卵母细胞受精后,未观察到RCC1在母源染色体和解聚的精子染色体位置浓集,而是在细胞中均匀分布。.原核形成后RCC1逐渐转移到核内,细胞质内的浓度逐渐降低。在小鼠睾丸支持细胞中,RCC1主要分布于有丝分裂间期细胞的细胞核中,核仁内没有分布,细胞质中浓度较低。RCC1的这种表达和分布情况,可以在细胞周期转换,核内输、外运,有丝分裂期纺锤体的组装及核膜的重组等过程中发挥作用,间期时与其它有机体的体内和体外实验中获得的结果是一致的,细胞分裂期未见RCC1在染色体周围的特异性分布。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 RCC1 的发现和命名
• 1.2 RCC1 的作用
• 1.2.1 RCC1 在核物质内输外运中的作用
• 1.2.2 RCC1 与染色体偶联产生RanGTP 的机制
• 1.2.3 RCC1 在核膜重组中的作用
• 1.2.4 RCC1 在DNA 复制中的作用
• 1.2.5 RCC1 在纺锤体组装中的作用
• 1.2.6 RCC1 核内输的调节机制
• 1.3 哺乳动物卵子发生与受精过程
• 1.4 本试验研究的目的及意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 主要器材和试剂
• 2.1.1 主要器材
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.2.1 M2 的配制：（1000ml）
• 2.1.2.2 α－MEM 的配制
• 2.1.2.3 10 x PBS 的配制（100ml）
• 2.1.2.4 固定液：4%多聚甲醛（formaldehyde）的配制
• 2.1.2.5 孵育液（透膜液）的配制
• 2.1.2.6 清洗液的配制
• 2.1.2.7 封闭液的配制
• 2.1.2.8 溴代碘碇（PI）工作液的配制
• 2.1.2.9 防荧光淬灭剂的配制
• 2.1.2.10 细胞培养液的配制（100ml）
• 2.1.2.11 消化酶的配制
• 2.1.2.12 裂解液配方
• 2.1.3 实验动物
• 2.2 实验过程
• 2.2.1 小鼠卵母细胞的收集与培养
• 2.2.2 小鼠胚胎细胞的获取
• 2.2.3 小鼠睾丸支持细胞的培养
• 2.2.4 组织细胞的制片
• 2.2.5 共聚焦显微术
• 2.2.6 胚胎总RNA 的提取步骤
• 2.2.7 巢式PCR
• 3 实验结果
• 3.1 巢式RT-PCR 检测RCC1 基因表达情况
• 3.2 RCC1 在小鼠卵母细胞减数分裂成熟、受精和早期胚胎有丝分裂过程中的定位
• 3.2.1 RCC1 在小鼠卵母细胞成熟过程中的定位
• 3.2.2 RCC1 在小鼠卵母细胞受精、原核形成和原核破裂过程中的定位
• 3.2.3 RCC1 在小鼠早期胚胎有丝分裂过程中的定位
• 3.2.4 RCC1 在小鼠睾丸支持细胞中的定位
• 4 讨论
• 4.1 试验结果的可靠性
• 4.2 RCC1mRNA 在卵母细胞和早期胚胎细胞中的表达
• 4.3 RCC1 在细胞间期的定位
• 4.4 RCC1 在卵母细胞减数分裂、早期胚胎中的定位
• 4.5 RCC1 在核膜破裂、重组和细胞核形成过程中的定位
• 4.6 RCC1 在细胞周期控制中的作用
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文