猪CD163基因的克隆表达及其抗体制备

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus, PRRSV）是一种严重危害养猪业的主要病原。PRRSV主要以肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages, PAM）作为靶细胞,通过与宿主细胞受体相互作用,引起机体过强天然免疫应答和适应性免疫应答。CD163是存在于单核-巨嗜细胞表面的特异性受体,属于I型跨膜蛋白。PRRSV非允许细胞系在瞬时和稳定表达CD163分子后均支持I型和II型PRRSV感染,并产生子代病毒粒子,表明CD163分子在病毒粒子脱壳释放过程中发挥作用。在PRRSV感染过程中,受体CD163的SRCR5结构域与PRRSV的糖基化膜蛋白GP2和GP4相互作用,促进病毒脱壳,病毒粒子从酸性小泡释放到胞浆中开始转录翻译形成新的病毒粒子,而删除CD163分子的胞质尾区可以促进PRRSV的复制增殖。为了解CD163 SRCRs结构域在PRRSV感染过程中的功能以及CD163与其它受体的相互作用机制,本研究原核表达并纯化CD163蛋白的胞质外区SRCR4-SRCR5,免疫新西兰白兔和BALB/c小鼠,制备了兔抗猪CD163多克隆抗体及单克隆抗体并进行抗体功能鉴定。实验结果如下:1.构建了表达猪CD163基因胞质外区SRCR4-SRCR5的原核表达载体pGEX-6P-CD163,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析证实获得了相应大小的融合蛋白GST-CD163。2.通过切胶纯化方法对GST-CD163融合蛋白进行纯化,得到纯度较高的目的蛋白。将纯化蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗猪CD163多克隆抗体,并通过流式细胞技术和抗体阻断实验对多克隆抗体进行鉴定。3.纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞用50% PEG（4000）进行融合。采用间接ELISA方法和Western Blot检测融合后存活的细胞。通过有限稀释法筛选得到1株抗GST阳性杂交瘤细胞株,命名为3E2F2;抗CD163的阳性克隆细胞株还在进一步筛选中。在本研究中,我们获得兔抗猪CD163多克隆抗体及一株抗GST的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分泌CD163单克隆抗体的杂交瘤细胞还在进一步筛选中。如果能够得到一株分泌CD163抗体的单克隆细胞,将为进一步研究CD163受体在PRRSV感染过程中发挥的具体作用奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 CD163 分子及其在PRRSV 感染过程中的作用研究进展
• 1.1 CD163 分子结构、功能及表达
• 1.2 CD163 作为PRRSV 受体的研究
• 1.2.1 硫酸乙酰肝素
• 1.2.2 唾液酸粘附素
• 1.2.3 CD163 分子
• 1.2.4 细胞蛋白酶和其它相关因子
• 1.3 CD163 与PRRSV 相互作用研究
• 1.4 PRRSV 感染过程中CD163 与IL-10 的关系
• 试验研究
• 第二章 猪CD163 基因的克隆表达
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 实验载体和菌株
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 表达猪CD163 基因外膜区的原核表达质粒构建
• 2.2.2 重组质粒的诱导表达及鉴定
• 2.2.3 重组蛋白切胶纯化
• 2.2.4 真核表达载体构建
• 2.2.5 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.6 重组质粒的大量提取
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 猪CD163 基因胞质外区部分基因CD163 的PCR 扩增
• 2.3.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.3 重组质粒 pGEX-6P-CD163 原核表达产物的 SDS-PAGE 检测结果
• 2.3.4 原核表达产物的Western-blot 分析
• 2.3.5 真核表达猪CD163 胞质外区PCR 扩增
• 2.3.6 真核表达质粒的双酶切鉴定
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 抗猪CD163 蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 实验动物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 动物免疫程序
• 3.2.2 间接ELISA 方法的建立
• 3.2.3 Western Blot 检测多抗血清效价
• 3.2.4 流式检测兔多抗血清的特异性
• 3.2.5 抗体阻断实验
• 3.2.6 荧光定量检测 HP-PRRSV N 基因
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 间接ELISA 检测多抗血清效价
• 3.3.2 Western Blot 检测兔多抗血清效价
• 3.3.3 流式检测兔抗猪多克隆抗体的特异性
• 3.3.4 抗体阻断实验的荧光定量PCR 检测PRRSV 复制结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 抗猪CD163 蛋白单克隆抗体的制备
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 实验动物及细胞
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 动物免疫程序
• 4.2.2 骨髓瘤细胞的复苏与培养
• 4.2.3 饲养层细胞的制备
• 4.2.4 间接ELISA 方法建立
• 4.2.5 免疫脾细胞的制备
• 4.2.6 细胞融合
• 4.2.7 间接ELISA 检测阳性克隆
• 4.2.8 间接免疫荧光检测方法的建立
• 4.2.9 单克隆细胞株的建立
• 4.2.10 Western Blot 检测单抗特异性
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 间接ELISA 检测免疫小鼠血清效价
• 4.3.2 融合杂交瘤细胞的形态观察
• 4.3.3 细胞株分泌单抗间接ELISA 结果
• 4.3.4 细胞株分泌单抗间接免疫荧光结果
• 4.3.5 杂交瘤细胞株的筛选
• 4.3.6 细胞株分泌单抗特异性测定
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 个人简介