论文摘要
桑蚕 Bombyx mori 丝丝心蛋白（silk fibroin）结晶域与人类帕金森综合症的致病蛋白α-突触核蛋白（α-synuclein,简称α-Syn）的积聚原理类似,由一段非常疏水的氨基酸组成的保守序列和一些无规卷曲在一定条件下发生整体的结构转换而导致纤维化所致。研究发现在这两种蛋白中存在的疏水片段是形成β折叠的关键。在体外试验中已经证明α-Syn 蛋白很容易积聚成纤维物,并且其中的66VGGAVVTGV74 序列对其积聚起决定性作用。为了进一步确证这一观点,前人通过基因重组的方法单独表达了α-Syn65（α-Syn 蛋白 N-末端氨基酸残基 1-65）和α-Syn74（α-Syn 蛋白 N-末端氨基酸残基 1-74）蛋白片段并研究其积聚行为,结果表明蛋白质中的局部区域对其整体的积聚行为有调节作用。GAV 基序需要存在于具有无规卷曲的结构的宿主蛋白中才能引发其整体的结构转换,并发生纤维化。α-突触核蛋白的片段为“66VGGAVVTGV74”（简称 GAV 基序）。该基序由 Gly,Ala, Val 三种氨基酸残基组成,它们在蛋白质的积聚过程中可能起到不同的作用。Gly 最具柔性,有助于序列在溶液中保持无规卷曲状态;Ala 可以诱导形成蛋白质二级结构;而疏水性的 Val 具有很强的形成β-折叠的趋向。在蚕丝丝心蛋白结晶区中含有大量疏水性的、保守性很强的重复序列, 它们主要由 Gly,Ala 和 Val 组成。丝心蛋白结晶域的几段重复片段为 “VGYGAGV” 、“VGAGYGV”、“YGAGVGAGY” 、“GAGAGSGAGA” 和“VGAGYGAGAG”（以上简称 SFX）。而 SFX 是构成β片层的重要成分。桑蚕丝心蛋白由无规卷曲向β折叠的转变及积聚过程中及蚕吐丝过程存在着成核依赖型的机理。由于α-Syn74积聚比α-Syn 更快,过程更典型,为了便于构建质粒,研究α-Syn 蛋白的积聚核心在被其它积聚核心所替换后是否还可以正常纤维化,我们用桑蚕丝丝心蛋白的重复片段替换α-Syn74的核心。利用 pET 载体系列的通用引物 T7 promoter prime和与基因序列特异性结合的引物进行 PCR 反应,然后通过基因上的 Nde I 和BamH I 酶切位点直接双酶切后,将产物插入到 pET-3a 表达载体上。对α-Syn74的 GAV 基序用 SFX 替换,构建出α-Syn74SFX。将α-Syn74SFX 依次用离子交换柱和 FPLC 分子筛柱进行纯化,温育 6 天后,用 THT 荧光和原子力显微镜（atomicforce microscope）检测该重组蛋白的结构,发现α-Syn74SFX 不能纤维化,这说明人α-Syn 蛋白的 GAV 基序在功能上不能被桑蚕 silk fibroin 的 SFX 序列替代,成为证明GAV基序对人α-Syn蛋白的特异积聚行为起重要作用的又一有力证据,为蛋白质淀粉样化的分子机制研究提供了借鉴,也对人工丝蛋白的研究具有指导意义。
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