重组人巨噬细胞炎症蛋白3α（MIP-3α）的克隆、原核表达及功能鉴定

论文摘要

巨噬细胞炎症蛋白3α（Macrophage inflammatory protein 3-α,MIP-3α）,是趋化因子（Chemokine）超家族成员。主要由表皮细胞或粘膜上皮细胞分泌的一类CC族趋化因子,特异性趋化郎格罕细胞（Langerhans Cells,LC）向表皮或粘膜上皮迁移。已知LC是皮肤中最重要的抗原递呈细胞,决定了皮肤组织的免疫反应特征,是异体皮肤移植后发生免疫排斥的主要原因;同时MIP-3α也具有趋化未成熟树突状细胞（DC）和淋巴细胞的功能,在炎症和肿瘤发生中起重要作用。作为趋化因子的重要的组成部份,越来越受到人们的关注。目前对MIP-3α的研究尚处于初步阶段。为此我们克隆了人MIP-3α成熟蛋白基因,构建了该基因的原核表达质粒,进行了重组蛋白的诱导表达、纯化及生物学活性的鉴定,旨在为进一步研究MIP-3α在肿瘤发展与转移、移植排斥反应和自身免疫性疾病中的作用机制及应用奠定基础,并且并以此为基础,获得多个MIP-3 alpha突变体蛋白,再从突变体中寻找具有拮抗CCR6活性的蛋白,然后在小鼠模型上观察,拮抗CCR6对减轻炎症的发生、降低皮肤排斥反应等方面的影响。该项研究取得的主要结果如下:1.从人扁桃体中提取RNA,RT-PCR成功获得编码人MIP-3α成熟蛋白的DNA片段,并将该片段插入原核表达质粒pET32a（+）,成功构建了重组原核表达质粒pET32a（+）/MIP-3α（+3）,通过突变去掉目的基因与肠激酶位点间的三个氨基酸,经测序,与GenBank上登录的人MIP-3α成熟蛋白cDNA序列完全一致,获得MIP-3α天然蛋白的重组原核表达质粒pET32a（+）/MIP-3α。2.将该质粒转化大肠杆菌BL21trxB（DE3）,经IPTG诱导,获得了高水平表达的融合蛋白（TrxA- MIP-3α）,并确定融合蛋白在BL21trxB（DE3）中高效表达的最佳诱导条件为终浓度0.2mmol/L的IPTG在18℃诱导表达15小时。SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的大小约为25KD,占菌体总蛋白的30%以上,可溶性蛋白约占总融合蛋白的50%。3.将大量表达的融合蛋白经TALON金属亲和树脂纯化、除盐、强阳离子交换层析、再除盐、肠激酶消化、弱阳离子交换层析,得到高纯度的MIP-3α重组蛋白。纯化后的蛋白在SDS-PAGE上呈现单一条带。

论文目录

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• 论文正文 重组人巨噬细胞炎症蛋白3α（MIP-3α）的克隆、原核表达及功能鉴定
• 前言
• 第一部分 人趋化因子MIP-3α原核表达载体的构建
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 人趋化因子MIP-3α在BL21 E.coli 中的表达与纯化
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 人趋化因子MIP-3α的活性鉴定
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述 趋化因子与淋巴细胞
• 参考文献
• 研究生期间发表的文章