一株苜蓿花叶病毒的全基因组序列及其寄主生物学研究

论文摘要

苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus, AMV）是侵染苜蓿和三叶草等豆科植物的主要植物病毒,能引起花叶,斑纹,皱缩等症状。本研究通过双链RNA（Double-stranded RNA,dsRNA）提取和改进的单引物扩增技术（Modified single primer amplification technique, SPAT）于白三叶草（Trifolium repens）上分离得到一株AMV,并对分离的AMV进行序列分析和寄主生物学研究,探讨该AMV与同科的黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）标准株系Fny构建的假重组体的侵染活性。我们首先从杭州下沙采集到表现黄色斑纹叶的白三叶草,以此为毒源经过汁液摩擦接种至指示植物心叶烟（Nicotiana glutinosa）,发现该病毒能够在心叶烟上引起感病症状,从心叶烟的叶组织中提取dsRNA发现类似AMV基因组大小的dsRNA条带。所有dsRNA条带通过M-SPAT进行基因扩增,并克隆和测序获得其全长序列信息。序列分析表明从白三叶草上分离得到的病毒为AMV,命名为AMV-HZ。AMV-HZ的RNA1全长3643nt,编码1126个氨基酸序列的P1蛋白;RNA2全长为2595nt,编码804个氨基酸序列的P2蛋白;RNA3全长为2041nt,编码300个氨基酸序列的移动蛋白和218个氨基酸序列的外壳蛋白（Coat protein, CP）。三条基因组序列信息公布于GenBank数据库,登录号分别为HQ316635、HQ316636和HQ316637。蛋白质氨基酸序列比对结果发现AMV-HZ与NCBⅠ上公布的27个AMV株系的CP同源性高达9299%,所有株系间的CP氨基酸序列同源性在90%以上。但在氨基酸序列比对分析中发现株系Caa1、Dac16、Lyh 1、VRU和Lye 80在67、72、84、176、212、221和214七个氨基酸位点上与其它株系有较大的差别。进化分析结果可以将AMV株系分成两个分组（Ⅰ组和Ⅱ组）,株系Caa1、Dac16、Lyh 1、VRU和Lye 80组成Ⅱ组,AMV-HZ与其它多数株系一样属于Ⅰ组。Ⅰ组和Ⅱ组CP碱基序列间存在限制性酶切位点的差异。利用设计的AMV基因组全长引物和通用探针,对AMV-HZ的侵染进行了RT-PCR及Northern blot杂交验证。寄主生物学研究表明, AMV-HZ能在烟草属植物（ Nicotiana spp. ）、苋色藜（Chenopodium amaranticolor）、朝天椒（Capsicum frutescens var）上引起病症,病症随着时间推移发生变化。在心叶烟上,典型症状为:系统性褪绿花叶,局部出现蚀纹和泛白斑;在本生烟（Nicotiana benthamian）上的典型症状为:系统性褪绿黄斑叶,有局部的明脉现象;在三生烟（Nicotiana tobacum cv.Samsun NN）上的典型症状是:系统性褪绿黄色纹状花叶;在苋色藜上典型症状为:系统性黄色斑纹叶;在朝天椒上的典型症状为:系统性亮黄色块斑叶,呈现橡树叶状。本研究还构建了AMV-HZ与CMV-Fny间的人工假重组体F1F2A3,体外转录实验证实此重组体没有侵染活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 苜蓿花叶病毒概述
• 1.1.1 苜蓿花叶病毒的生物学特性及基因组结构
• 1.1.2 苜蓿花叶病毒的侵染性克隆研究
• 1.1.3 苜蓿花叶病毒复制上的CP 与RNAs 的3′UTRs 互作研究
• 1.1.4 苜蓿花叶病毒的分子检测及其在进化学上的意义
• 1.2 快速克隆dsRNA 获得病毒全长序列方法
• 1.3 本研究的内容和意义
• 1.3.1 研究内容
• 1.3.2 研究意义
• 第二章 一株苜蓿花叶病毒的全基因组序列分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 毒源的采集及转接
• 2.1.2 酶及试剂
• 2.1.3 心叶烟上的dsRNA 检测
• 2.1.4 M-SPAT 扩增dsRNA
• 2.1.5 M-SPAT 产物的克隆
• 2.1.6 序列测定及分析
• 2.1.7 总RNA 提取
• 2.1.8 病毒粒子的提取
• 2.1.9 病毒粒子中提取RNA
• 2.1.10 RT-PCR 及Northern blot 杂交检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 症状观察
• 2.2.2 dsRNA 检测及回收结果
• 2.2.3 M-SPAT 结果
• 2.2.4 重组质粒筛选结果
• 2.2.5 序列分析结果
• 2.2.7 病毒粒子中提取RNA 结果
• 2.2.8 RT-PCR 及Northern blot 杂交验证结果
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 AMV-HZ 的寄主生物学研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.2 寄主
• 3.1.3 汁液摩擦接种
• 3.1.4 症状记录
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 AMV-HZ 在心叶烟上的表型分析
• 3.2.2 AMV-HZ 在本生烟上的表型分析
• 3.2.3 AMV-HZ 在三生烟上的表型分析
• 3.2.4 AMV-HZ 在苋色藜上的表型分析
• 3.2.5 AMV-HZ 在朝天椒上的表型分析
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 AMV-HZ 与CMV-Fny 的假重组体研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 CMV-Fny 侵染性克隆
• 4.1.2 酶与试剂
• 4.1.3 AMV-HZ 的RNA3 侵染性克隆质粒构建
• 4.1.4 体外转录
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 AMV-HZ 的RNA3 侵染性克隆质粒构建结果
• 4.2.2 假重组体的侵染活性检测结果
• 4.3 小结与讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录：重要溶液配制
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果