论文摘要
背景:C-反应蛋白是一种急性时相反应的标志物,属于高度保守的正五聚体血浆蛋白家族,在先天免疫系统中作为模式识别受体发挥功能。急性心肌梗塞（AMI）时,由于心肌缺血、损伤、坏死等病变,可导致血清CRP水平发生变化,已有大量临床资料表明,CRP增高和动脉粥样硬化、急性心肌梗塞预后相关。CRP作为炎症标记物,在心血管事件形成过程中是否仅仅是一个“旁观者”,是否直接参与心血管疾病的发生与发展过程,仍存在争议。近年来,越来越多的体外研究证据表明CRP损伤血管平滑肌细胞,血管内皮细胞,在动脉粥样硬化的发生、发展过程中起着直接作用。有研究发现急性心肌梗塞患者心脏的梗塞区有CRP沉积,而且CRP的含量与梗塞的范围呈正相关。此外,动物实验已证明针对CRP进行治疗,可以防止大鼠心肌梗塞模型中梗塞面积的增加,并且能消除注射人CRP后引起心脏功能紊乱的现象。这些研究提示,CRP可能加重了心肌梗塞的发展,已证明线粒体细胞色素C在心肌梗塞区细胞凋亡过程中发生转移,细胞色素C释放到胞质后可引发caspase活化级联反应,导致细胞死亡,但这些重要蛋白是否参与了C-反应蛋白致心肌损伤过程仍不明确,因此,探讨CRP加重心肌梗塞,致心脏功能紊乱的分子机制,寻找一种针对CRP治疗的更为高效无毒的药物是一项重要的探索性研究领域,引起了研究工作者和临床医生的兴趣和关注。目的:为探讨CRP对心肌细胞的直接损伤作用和分子机制,寻找一种阻断CRP致病作用的生物学治疗方法,本研究用获得的高纯度的人CRP蛋白对体外培养的缺氧状态下的乳大鼠心肌细胞进行干预,确定信号通路中重要蛋白,作为治疗靶点进行干预研究;从稳定分泌CRP单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出抗体可变区,VH、VL通过Linker连接形成单链抗体,通过大肠杆菌表达后进行纯化,初步探讨CRP单链抗体对CRP致心肌细胞损伤的保护作用。内容与方法:1.采用Immobilized p-Aminophenyl phosphoryl Cholnie Gel亲和层析柱从感染、炎症期及肿瘤患者胸水中分离、纯化CRP,用质谱鉴定其成分,并通过SDS-PAGE与western blot检测其纯度与特异性。2.从经TNF-alpha刺激的肝癌细胞系HepG2中,通过RT-PCR的方法,克隆人C-反应蛋白基因,并分别构建原核和真核表达载体,对原核表达载体进行了诱导表达和纯化,真核载体（pEGFP-N1-CRP）脂质体介导转染HEK293T细胞,荧光显微镜观察及western印迹法鉴定目的蛋白的表达。3.克隆大鼠Bcl-2 cDNA序列,构建真核表达载体（pEGFP-N1-Bcl2）（Bcl-2 cDNA中含终止密码子TGC）。分离乳大鼠心肌细胞,空载体pEGFP-N1和pEGFP-N1-Bcl2脂质体介导转染培养分离的心肌细胞,荧光显微镜观察及Western blot鉴定目的蛋白的表达。4.观察CRP干预对体外培养的乳大鼠心肌细胞的影响（1）实验分为三组:A.未转染组;B.pEGFP-N1转染组;C.pEGFP-N1-Bcl-2转染组。各组转染后48h,分别进行缺氧、100μg/ml CRP及缺氧+100μg/ml CRP干预;对照组为DMEM+10%FCS,正常氧含量、5%CO2,37℃环境下培养。各组实验至少重复三次。（2）Hochest 33258检测各组细胞凋亡情况。（3）激光共聚焦免疫荧光定位和Western blot法分析细胞色素C在各组细胞中的分布,探讨细胞色素C的改变情况及其意义。（4）RT-PCR和western blot分析各组细胞中Bax,Bcl-2的表达以及Bax/Bci-2的比值。用Caspase活性测定试剂盒分析各组细胞中Caspase-3,Caspase-9的活性。5.从稳定分泌CRP单抗的杂交瘤中克隆出CRP-McAb可变区序列,通过Linker体外装配CRP单链抗体,构建原核、真核表达载体。对原核表达载体pET-28a-scFv诱导表达,包涵体蛋白经变性、复性,镍柱纯化,并通过SDS-PAGE与western blot进行鉴定。真核表达载体pEGFP-N1-scFv脂质体介导转染HEK293T细胞,荧光显微镜观察转染情况及western印迹法鉴定目的蛋白的表达。细胞免疫组化检测转染细胞表达的scFv对CRP的识别能力。6.观察CRP-scFv对CRP所致乳大鼠心肌细胞损伤的影响,初步探讨scFv对损伤乳大鼠心肌细胞保护作用。7.统计学方法:数据均测量数据以平均数加标准差（（?）±s）表示。组间差异采用独立样本t检验、单因素方差分析和x2检验（SPSS 13.0）,P＜0.05有统计学意义。结果1.采用亲和层析法从肿瘤患者腹水中成功纯化出大小为24KD蛋白,SDS-PAGE检测纯度超过95%,用anti-CRP抗体进行western blot检测未见杂带,质谱鉴定表明所得蛋白为人C-反应蛋白。2.成功克隆出人C-反应蛋白全长cDNA序列,测序证实与Genebank标准序列完全符合,并成功克隆至pET-28a和pEGFP-N1载体中。原核表达载体经1mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测在30KD处有一亮带,经western blot证实此条带为His-CRP融合蛋白。经镍柱亲和层析获得纯化的重组CRP蛋白。脂质体介导重组质粒pEGFP-N1-CRP转染HEK293T细胞,荧光显微镜观察及western印迹法均证实有目的蛋白表达。3.成功克隆出大鼠Bcl-2全长cDNA序列,测序证实与Genebank标准序列完全符合,并成功克隆至pEGFP-N1载体中。成功通过M-PEI介导成功将重组pEGFP-N1-Bcl-2转染至分离培养的乳大鼠心肌细胞中,并通过western印迹法证实有目的蛋白表达。4.CRP加重缺氧心肌细胞的凋亡。心肌细胞缺氧8h后凋亡率较对照组显著增加（P＜0.001）,缺氧同时用100μg/ml CRP进行干预,细胞凋亡率比单独进行缺氧干预有显著性增加（P＜0.05）。5.CRP加重缺氧心肌细胞线粒体中细胞色素C外流。细胞免疫荧光显示,对照组细胞中细胞色素C分布于线粒体中,缺氧8h细胞组中有少量细胞色素C发生移位,从线粒体转移至胞浆中,但当同时用缺氧和100μg/ml CRP进行干预时,细胞胞浆中弥散有大量细胞色素C。分别提取各组细胞线粒体和胞浆蛋白,用western blot分析进一步得到了证实。6.RT-PCR和western blot检测显示CRP显著升高缺氧心肌细胞线粒体膜蛋白Bax/Bcl-2的比值。7.CRP加重缺氧心肌细胞Caspase-9,Caspase-3的激活。单独缺氧干预8h,Caspase-9和Caspase-3活性与对照组相比均显著升高（P＜0.05）。缺氧和CRP同时干预组Caspase-9和Caspase-3活性与单独缺氧组相比显著升高（P＜0.05）,但单独CRP干预后,Caspase-9和Caspase-3活性与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。8.转染pEGFP-N1-Bcl-2后48h,DMEM培养基条件下,缺氧同时用100μg/ml CRP干预8h后心肌细胞比未转染细胞缺氧8h后凋亡率显著降低（P＜0.05）。在缺氧或同时用CRP干预条件下,过量表达Bcl-2蛋白不抑制细胞内Bax转录和表达水平,但Bax/Bcl-2比值比同样干预条件下的未转染组有显著下降。Bcl-2蛋白过表达抑制细胞色素C从线粒体向胞浆转移,进而抑制Caspase-9和Caspase-3活化。9.成功从稳定分泌CRP单抗的杂交瘤中克隆出CRP-McAb可变区序列,测序后与V-Base数据库比对,确定阅读框,重叠延伸（overlap extend PCR）PCR将VH和VL通过Linker连接,并成功克隆入pET-28a和pEGFP-N1载体中。原核表达载体经1mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测在30KD处有一亮带,经western blot证实此条带为His-scFv融合蛋白。经镍柱亲和层析获得纯化的重组scFv蛋白。脂质体介导重组pEGFP-N1-scFv转染HEK293T细胞,荧光显微镜观察,western印迹法均证实有目的蛋白表达。细胞免疫组化结果证明表达的scFv可识别人CRP蛋白。10.凋亡检测初步结果表明anti-CRP单克隆抗体（4E8C6H6F12E7D11）和重组scFv蛋白可抑制CRP诱导的缺氧心肌细胞的凋亡。结论与讨论:1.本研究中采用Immobilized p-Aminophenyl phosphoryl CholnieGel亲和层析柱从感染、炎症期及肿瘤患者胸水中分离、纯化CRP,此法得到的CRP纯度高,无NaN3污染,符合体外干预实验要求。2.CRP加重缺氧诱导的乳大鼠心肌细胞的损伤,而对体外正常培养心肌细胞无影响。该结果与Pepys MB等在大鼠心肌梗塞模型中注射人类CRP后,出现梗死面积增加的现象相一致。表明体外培养心肌细胞进行缺氧+CRP处理是可用的细胞水平实验模型。3.本研究发现心肌细胞线粒体膜蛋白Bax/Bcl-2的比值降低,导致线粒体膜通透性发生改变,细胞色素C从线粒体向胞浆转移,活化了Caspase-9和Caspaes-3可能是CRP加重缺氧诱导的乳大鼠心肌细胞凋亡的重要途径。过量表达Bcl-2蛋白后,CRP促凋亡作用被抑制,提示Bcl-2是该信号通路中重要蛋白,可作为靶点进行干预治疗。但在该通路上游,CRP是如何作用于损伤心肌细胞,还有待进一步深入研究。4.本研究中从稳定分泌CRP单抗的杂交瘤中克隆出CRP-McAb可变区序列,经过表达、纯化获得了针对CRP的单链抗体,初步研究结果表明该重组单链抗体可抑制CRP诱导的缺氧心肌细胞的凋亡,为运用基因工程抗体作为生物技术药物针对CRP进行治疗提供了理论基础。
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