禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae sensu lato）分子特征分析

论文摘要

2005-2007年对中国的华北和西北地区进行禾谷孢囊线虫（cereal cyst nematode，CCN）的调查。结果表明9个省市37个县市都有禾谷孢囊线虫的发生。新分布省是陕西省和甘肃省。本研究表明河南省、河北省、北京、山东省、山西省、青海省、甘肃省、陕西省等地禾谷孢囊线虫土壤中的卵量已达到或超过危害水平。本研究采用PCR技术扩增出CCN群体的核糖体基因（rDNA）的内转录间隔区（ITS）片段后用RFLP分析和建立系统关系树，对CCN群体进行分子鉴定和遗传分析。河南郑州的9个CCN群体rDNA-ITS扩增片段长度约为1040bp，其中2个片段测序结果为1045和1047bp。与近缘种进行聚类分析，发现郑州CCN群体近缘于H．australis。河南省郑州、青海省、陕西杨陵和内蒙古4地65个孢囊线虫群体采用PCR技术扩增得到rDNA-ITS片段。禾谷孢囊线虫的片段长度约1045bp，大豆孢囊线虫片段约1030bp，青海省HZXZ群体ITS扩增片段大小为1039bp，而CE18群体ITS仅有976bp。以青海省DT2A序列为例，将河南省SF2、XS2和XS3，与德国H．avenae、印度H．avenae、中国H．avenae、H．australis、H．pratensis和H．arenaria序列共同比对。DT2A与中国禾谷孢囊线虫H．avenae仅差2个碱基，与H．australis差3个碱基，H．pratensis差6个碱基，应该是更接近中国H．avenae。XS2、XS3和SF2与H．australis均差5个碱基，与中国H．avenae差4～6个碱基，与H．pratensis差5～8个碱基，应该与H．australis更接近。YL4A和YL4B与中国H．avenae差2～3个碱基，与H．australis差3～4个碱基，与德国H．avenae差7～8个碱基，近缘种应该是中国H．avenae种。青海孢囊线虫群体序列比对结果显示：DT2A、HY16B、HY16A、HY126A、HY114B、HZ13A、HHX8A、HY61A、ZZZZ2B、ZHZ164B、HY121B、HY111A、HY111B、HY112A、HY113B、DT141A、DT141B和DT143B这18个序列完全一致，来自大通县斜沟乡12、14；湟源县寺寨乡长岭村11、12；湟中县共和镇转嘴村16；湟源巴燕乡新寺村6；大通县桥头镇红河限村8，湟中县共和县苏尔吉村13，湟源16等10个地点。52个青海孢囊线虫群体与中国H．avenae、H．pratensis和H．australis比对结果显示：52个序列共有45个碱基差异，序列彼此间的差异仅在7个碱基以内；加入上述3个种比对则存在51个碱基差异，序列彼此间差异在10个碱基内。以ITS序列基础用UPGMA方法建立的系统发育树的结果显示：郑州、青海、陕西杨陵和内蒙古的孢囊线虫群体都与序列比对时的近缘种聚类在同一个分支上，并且置信度达90％以上，CE18和C．estonica的置信度为100％。与中国H．avenae同支的青海孢囊线虫群体亲缘极近，认为来源可能是相同的，很有可能是某地发生或传入后，向其它地区扩散的。郑州CCN群体与H．australis成簇。遗传距离的微弱差异，说明中国H．avenae，H．australis及H．pratensis亲缘关系相当近，而中国H．avenae、德国H．avenae和印度H．avenae遗传距离比前三者间的要远些。系统树显示Avenae组和Schachtii组亲缘关系较近，和Goettingiana组遗传距离相对较远。所有CCN孢囊群体的rDNA-ITS的PCR产物用HinfⅠ，TaqⅠ，HpaⅡ，HaeⅢ，PstⅠ，AluⅠ6种酶酶切。HaeⅢ、HinfⅠ和HpaⅡ酶切结果可以看出所有CCN孢囊群体被分成4组：Avenae组，Schachtii组，Goettingiana组和Cactodera属。PstⅠ和AluⅠ的酶切结果明显看出杨陵群体的异质性。TaqⅠ的RFLP图谱明显观察到Avenae孢囊群体间的区别：河南群体与H．australis酶切结果是一致的，青海CCN群体与中国H．avenae的酶切图谱一致，杨陵CCN群体酶切结果较为复杂。分离的孢囊进行形态学观察，河南CCN群体孢囊和阴门锥形态与H．australis形态描述相符，青海省群体HZXZ与H．urticae形态描述相符，其余CCN群体和H．avenae的描述相符合，CE18的孢囊形态是符合Cactodera属的描述。综合形态学观察和分子分析结果认为：河南郑州CCN群体应视为H．australis；青海CCN群体中HZXZ群体是H．urticae，其它CCN群体为中国H．avenae；杨陵CCN群体较为复杂，可能是混合型，但仍是H．avenae；内蒙古CCN群体中CE18是Cactodera estonica，其他孢囊群体是H．glycines。国内尚未见报道H．australis、H．urticae和C．estonica。所有序列注册在GenBank上，注册号从EU106164～EU106175，EU616683～EU616707和EU623603～EU623634。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 研究孢囊线虫种的重要性
• 1.2 目前国内外禾谷孢囊线虫研究进展
• 1.2.1 禾谷孢囊线虫发生现状
• 1.2.2 禾谷孢囊线虫的孵化特性
• 1.2.3 禾谷孢囊线虫的分子鉴别
• 1.2.4 禾谷孢囊线虫的防治方法
• 1.3 其它孢囊线虫发生的现状
• 1.3.1 大豆孢囊线虫发生的现状
• 1.3.2 豌豆孢囊线虫发生的现状
• 1.4 分类学和系统发育
• 1.5 线虫学种的概念和种的界定
• 1.6 系统发育和分级
• 1.7 分子技术
• 1.7.1 PCR技术
• 1.7.2 RFLP技术
• 1.7.3 RAPD技术
• 1.7.4 SSR技术
• 1.7.5 AFLP技术
• 1.7.6 反向点迹杂交
• 1.7.7 Real-time PCR
• 1.7.8 DNA芯片
• 1.8 分子技术在植物寄生线虫诊断中的应用
• 1.8.1 RFLP的应用
• 1.8.2 PCR的应用
• 1.8.3 RAPD-PCR的应用
• 1.8.4 多倍PCR的应用
• 1.8.5 AFLP的应用
• 1.9 本研究的目的与意义
• 第二章 我国小麦上孢囊线虫的发生危害调查
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 调查材料
• 2.1.2 孢囊线虫的分离
• 2.1.3 直接解剖观察
• 2.2 调查结果
• 2.2.1 各地禾谷孢囊线虫前期调查结果
• 2.2.2 青海省禾谷孢囊线虫发生的调查结果
• 2.2.3 青海省其它样品的调查结果
• 2.3 讨论
• 第三章 郑州小麦孢囊线虫rDNA-ITS分子特征分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 孢囊线虫的来源和分离
• 3.1.2 孢囊线虫DNA提取
• 3.1.3 PCR扩增
• 3.1.4 rDNA-ITS片段的测序及数据分析
• 3.1.5 阴门锥玻片的制作
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 rDNA-ITS的PCR扩增结果
• 3.2.2 序列分析结果
• 3.2.3 分离孢囊线虫初步观察
• 3.3 讨论
• 第四章 小麦根际孢囊线虫rDNA-ITS分子特征分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 线虫材料
• 4.1.2 酶及主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 孢囊线虫DNA提取
• 4.2.2 孢囊线虫rDNA-ITS的PCR扩增
• 4.2.3 孢囊线虫rDNA-ITS片段的获得
• 4.2.4 孢囊线虫的RFLP分析
• 4.2.5 阴门锥玻片的制作
• 4.3 孢囊线虫分子鉴定的结果
• 4.3.1 孢囊线虫rDNA-ITS的PCR扩增结果
• 4.3.2 孢囊线虫rDNA-ITS测序结果
• 4.3.3 孢囊线虫RFLP分析结果
• 4.4 孢囊线虫遗传系统分析结果
• 4.5 分离孢囊线虫初步观察
• 4.5.1 青海CCN群体形态描述
• 4.5.2 新庄群体形态描述
• 4.5.3 内蒙古CE18群体形态描述
• 4.6 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历