论文摘要
本实验旨在探讨与正常浓度葡萄糖相比,高浓度葡萄糖培养的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）凋亡调控基因bcl-2的表达变化及其与细胞凋亡和增殖的关系,并探讨应用天然植物成分白藜芦醇（resveratrol,Res）和RNA干扰技术抑制bcl-2的表达进而干预VSMCs凋亡与增殖的效果,以期为糖尿病血管并发症的防治提供新的思路。第一部分高糖对血管平滑肌细胞凋亡与增殖的影响研究目的:探讨与正常浓度葡萄糖相比,高浓度葡萄糖培养的VSMCs凋亡调控基因bcl-2的表达变化及其与细胞凋亡和增殖的关系。方法:体外组织贴块法培养VSMCs,分为正常浓度葡萄糖组（5.5mmol/L葡萄糖）、甘露醇高渗对照组（即5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇）和高浓度葡萄糖组（25mmol/L葡萄糖）,分别培养72小时后,以荧光实时定量PCR、Western blotting法检测bcl-2的mRNA和蛋白表达水平,流式细胞仪检测VSMCs的早期凋亡状况,MTT比色法检测VSMCs的增殖状况。结果:家兔VSMCs培养成功;与正常浓度葡萄糖组和甘露醇高渗对照组相比,高浓度葡萄糖组bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均显著增强（P＜0.05）,细胞凋亡减少、增殖增加,而前两组相互比较无统计学差异。结论:高浓度葡萄糖使VSMCs的抗凋亡基因bcl-2的mRNA和蛋白表达增强,细胞凋亡减少,增殖增加,而且该作用与渗透压的变化无关。第二部分白藜芦醇干预高糖培养的VSMCs凋亡与增殖的研究目的:探讨不同浓度的Res干预体外高糖培养的VSMCs凋亡与增殖状况的效果。方法:配制含有不同浓度Res的培养基,将高糖培养72h的VSMCs分为四组,即高糖对照组、高糖+50μmol/L Res组、高糖+100μmol/L Res、高糖+150μmol/L Res组,分别培养48小时,以荧光实时定量PCR、Western blotting法检测bcl-2的mRNA和蛋白表达情况,流式细胞仪检测VSMCs的早期凋亡状况,MTT比色法检测VSMCs的增殖状况。结果:与高糖对照组相比,三个白藜芦醇干预组bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均显著减低（P＜0.05）,细胞凋亡增加,增殖减少,而且,随Res浓度增加,该作用增强。结论:Res可显著抑制高糖培养的VSMCs的bcl-2的mRNA和蛋白表达,并使细胞凋亡增加,增殖减少,在一定范围内,该作用呈现浓度依赖性。第三部分shRNA抑制高糖培养的VSMCs bcl-2表达的研究目的:构建靶向家兔bcl-2基因的shRNA质粒载体,探讨体外RNA干扰技术抑制bcl-2基因表达的效果,并筛选相对高效的shRNA质粒。方法:构建靶向家兔bcl-2基因的2个shRNA质粒载体,将高糖培养72h的VSMCs分为五组,即高糖对照组、高糖+转染剂Lipofectamine组、高糖+pHK-shRNA阴性质粒对照组、高糖+pbcl-21-shRNA质粒干预组和高糖+pbcl-22-shRNA质粒干预组,分别转染VSMCs,48小时后,以荧光实时定量PCR、Western blotting法检测bcl-2的mRNA和蛋白表达情况。结果:pbcl-2-shRNA质粒载体构建成功;与高糖对照组、Lipofectamine组和pHK-shRNA阴性质粒对照组相比,两个pbcl-2-shRNA质粒干预组bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均显著减低（P＜0.05）,其中,pbcl-21-shRNA质粒干预组更为明显。结论:应用成功构建的bcl-2-shRNA质粒载体转染家兔VSMCs,可显著抑制高糖培养的VSMCs的bcl-2的mRNA和蛋白表达,pbcl-21-shRNA为相对高效的shRNA质粒,可进一步应用于体内实验。