固体脂质纳米粒口服药物载体经胃肠道转运的研究

论文摘要

在对固体脂质纳米粒给药系统的制备工艺与理化性质进行了系统研究的基础上,采用荧光标记技术,对脂质纳米粒通过胃肠道转运过程及其对细胞膜通透性进行了考察,为脂质纳米粒作为口服药物载体的应用提供理论与技术依据。本研究合成了一种与脂质材料嫁接的荧光物质作为脂质纳米粒的荧光标记物,利用Caco-2单层细胞为小肠上皮细胞模型,通过荧光强度的观察与测定,考察脂质纳米粒通过肠上皮细胞吸收与转运的能力,初步研究其转运的机制和影响转运的因素;通过大鼠灌胃与淋巴引流技术,考察脂质纳米粒胃肠道吸收的效率和吸收途径;以紫杉醇为模型药物,考察载药脂质纳米粒通过肠细胞转运和胃肠道吸收的过程与生物利用度;并进一步考察了脂质纳米粒对细胞膜通透性的影响,以及对药物药理作用的影响。采用化学嫁接的方式合成一种新型的荧光素嫁接物——硬脂胺-异硫氰基荧光素（Octadecylamine-fluorescein isothiocyanate,ODA-FITC）作为荧光标记物,通过溶剂扩散法,制备荧光标记的硬脂酸、单甘酯等固体脂质纳米粒,测定其粒径、表面电位（Zeta电位）、标记物包封率,考察了标记物在模拟人工胃肠液、血液中的稳定性。采用水性溶剂扩散法制备的荧光标记固体脂质纳米粒,其粒径分布在150～300nm的范围内,呈单峰分布,且多分散系数较小。由于硬脂胺-FITC具有的18碳疏水链与脂质材料的性质相近,亲和力强,从而使两者在形成荧光标记SLN的过程中能够非常紧密地结合,不易分离泄漏。在标记的纳米粒中荧光素的包封率大于90%。体外稳定性考察表明,荧光标记SLN中的荧光素嫁接物在模拟胃肠液中泄漏非常慢,24 h泄漏量小于3%;而在血样中,24 h的泄漏量也在8%以下。以人结肠癌上皮细胞Caco-2单层细胞为模型,进行脂质纳米粒通过肠上皮细胞的渗透试验,考察不同脂质材料的纳米粒、不同的抑制剂和渗透条件以及添加剂油酸、卵磷脂对纳米粒经肠细胞渗透的影响。与游离的荧光标记物相比,荧光标记的脂质纳米粒可迅速通过肠细胞渗透,在100μg/ml的条件下,硬脂酸与单甘酯脂质纳米粒的渗透系数分别为7×10-5cm/s和4.7×10-5cm/s,能够满足通过胃肠道吸收的要求;在加入抑制剂秋水仙素或氯喹、加甲醛使细胞失活、低温培养和加入未标记纳米粒等试验条件下,纳米粒从肠细胞的浆膜侧向基膜侧的转运速率明显下降,而由基膜侧向浆膜侧的渗透未受明显的影响,说明脂质纳米粒通过肠细胞的渗透是细胞内吞的主动转运和通过肠细胞层脂质通道被动扩散相结合的模式进行转运。在单甘酯脂质纳米粒的处方中添加油酸和卵磷脂可显著提高纳米粒的渗透速率,加入20%（W/W）的油酸可使渗透系数提高到7.9×10-5cm/s,而油酸的加入同样也加快了脂质纳米粒从基膜侧向浆膜侧的转运,这可能是由于加入油酸后脂质的熔点下降,和油酸本身的促进吸收作用引起的;加入20%（W/W）的卵磷脂可使渗透系数提高到8.0×10-5cm/s,而从基膜侧向浆膜侧的转运则无明显变化,可能是卵磷脂的加入提高了纳米粒与细胞膜的亲和性,使纳米粒的细胞摄取更容易进行。大鼠灌胃荧光标记SLN后,在灌胃后2 h收集的血样和淋巴液中,可以清楚观察到比较强的荧光斑点。随着给药后时间的变化,血液中的纳米粒含量出现了两个峰值。第一个峰出现在1 h左右,说明纳米粒在胃肠道可以较快地被吸收;第二个浓度峰则出现在8 h左右,这可能与纳米粒进入体内后,在组织和血液之间的再分布有关。通过静脉注射荧光标记脂质纳米粒,估算得到固体脂质纳米粒生物转运效率约为30%,在实验设计的给药剂量范围内,随着剂量的增加,SLN浓度-时间曲线下面积（AUC）与给药剂量呈线性相关关系。通过淋巴引流技术,测定胃肠道转运后淋巴液中脂质纳米粒的含量,结果表明,在经胃肠道生物转运的SLN中约有77.9%的SLN经淋巴转运途径进入体循环,另有22.1%的SLN经非淋巴途径转运吸收。经PEG修饰后的脂质纳米粒大鼠灌胃后,纳米粒在血液中的峰浓度有所下降但滞留时间延长,由于在循环系统中停留的时间延长,脂质纳米粒的生物利用度可增加至约50%;随着PEG修饰比例的增加或修饰PEG分子量的增大,血液中纳米粒的峰浓度逐渐下降、滞留时间进一步延长。采用溶剂扩散法制备紫杉醇单甘酯纳米粒和PEG修饰的紫杉醇单甘酯纳米粒,PEG修饰对载药纳米粒的粒径和紫杉醇的包封率未有明显的影响,纳米粒的粒径在180～240nm,药物包封率为83%～95%。载药纳米粒通过Caco-2单层细胞的渗透试验结果显示,经PEG修饰的脂质纳米粒载体可显著促进紫杉醇通过肠细胞的转运,其渗透速率随着PEG修饰比例的增加而增加,10%PEG修饰的紫杉醇脂质纳米粒的渗透速率是游离药物的5倍。对大鼠灌胃给予紫杉醇脂质纳米粒,在给药2h后血药浓度开始明显增加,至6～8h可产生最大吸收,血药浓度维持时间比较长,与静脉注射相比,其绝对生物利用度可达到24.35%,为游离药物直接口服给药的3.72倍,为紫杉醇制剂的口服给药提供了可能。药物主要通过占位效应实现药物的最终疗效,大部分药物的靶点位于靶细胞内,药物分子渗透进入靶细胞内是口服药物继胃肠道吸收屏障外另一影响药物活性作用发挥的因素。脂质纳米粒利用其结构与细胞膜的亲和性,可经细胞摄取转运至细胞内,从而改变了生物膜的通透性。以A549细胞为模型细胞,用ODA-FITC标记含单甘酯纳米粒、含有油酸的脂质纳米粒和经叶酸-硬脂酸嫁接物修饰的脂质纳米粒,荧光倒置显微镜观察并比较细胞对不同脂质纳米粒的摄取能力。研究表明,随着纳米粒中油酸的加入和叶酸修饰,A549细胞对纳米粒的摄取增强;与游离药物相比,载紫杉醇脂质纳米粒对SKOV3细胞的毒性也显著增强,且随着油酸的加入和叶酸修饰,药物的毒性分别增加至3.0和4.6倍。多药耐药（multidrug resistance,MDR）是当前临床上恶性肿瘤化疗遭遇失败的关键因素。以耐紫杉醇的卵巢癌细胞（SKOV3-TR30）考察载紫杉醇脂质纳米粒的药效,MTT法测定紫杉醇对耐药细胞SKOV3-TR30及其敏感乳细胞SKOV3的细胞毒性,耐药细胞的耐药倍数为敏感细胞的58.4倍。以紫杉醇溶液为对照,以MTT法测定载药纳米粒对耐药细胞SKOV3-TR30及其敏感乳细胞SKOV3的细胞毒性,紫杉醇载药脂质纳米粒和叶酸修饰的紫杉醇载药脂质纳米粒对耐药细胞的逆转倍数分别为31.2和28.2倍,能够逆转耐药肿瘤细胞的耐药性。

论文目录

第一部分中文摘要

第二部分英文摘要

第三部分导论

第四部分正文

第一章荧光标记固体脂质纳米粒的制备及理化性质研究

1.材料与仪器

2.实验方法

2.1 硬脂胺-异硫氰基荧光素嫁接物的合成

2.2 荧光标记固体脂质纳米粒的制备

2.3 荧光标记固体脂质纳米粒的理化性质考察

2.4 PEG修饰荧光标记固体脂质纳米粒的制备

2.5 PEG修饰的荧光标记固体脂质纳米粒的理化性质研究

2.6 顺磁性及荧光标记固体脂质纳米粒的制备

3.结果与讨论

3.1 荧光嫁接物的结构确证

3.2 荧光标记纳米粒粒径分布和包封率

3.3 荧光标记纳米粒体外稳定性

3.4 PEG修饰纳米粒的理化性质

3.5 顺磁、荧光标记SLN的理化性质

4.小结

第二章固体脂质纳米粒经肠上皮细胞转运的研究

1.材料与仪器

2.实验内容

2.1 荧光标记单甘酯固体脂质纳米粒的合成

2.2 Caco-2细胞的培养和评价

2.3 固体脂质纳米粒的细胞毒性评价

2.4 Caco-2单层细胞转运实验

3.结果与讨论

3.1 固体脂质纳米粒的细胞毒性

3.2 不同材料固体脂质纳米粒的转运

3.3 单甘酯纳米粒的浓度对转运的影响

3.4 条件的改变对转运的影响

3.5 添加剂对脂质纳米载体转运的影响

4.小结

第三章固体脂质纳米粒的小肠吸收试验

1.材料与仪器

2.实验与方法

2.1 荧光标记固体脂质纳米粒的制备

2.2 PEG2000修饰固体脂质纳米粒制备

2.3 固体脂质纳米粒理化性质考察

2.4 固体脂质纳米粒小肠吸收考察

2.5 样品分析测定

3.结果与讨论

3.1 纳米粒粒径与电位

3.2 固体脂质纳米粒小肠吸收

4.小结

第四章固体脂质纳米粒动物体内胃肠道转运的研究

1.材料与仪器

2.实验方法

2.1 生物样本中荧光标记SLN的检测

2.2 PEG修饰纳米粒生物样本测定方法学考察

2.3 固体脂质纳米粒大鼠口服转运考察

2.4 PEG修饰固体脂质纳米粒经大鼠胃肠道转运的考察

3.结果与讨论

3.1 荧光标记SLN的生物样本测定方法学

3.2 PEG修饰荧光标记SLN的生物样本测定方法学

3.3 固体脂质纳米粒大鼠体内的生物转运

3.4 PEG修饰固体脂质纳米粒大鼠口服转运

4.小结

第五章紫杉醇固体脂质纳米粒的体内药动学研究

1.材料与仪器

2.实验方法

2.1 紫杉醇脂质纳米粒的制备

2.2 紫杉醇含量测定方法

2.3 紫杉醇脂质纳米粒通过肠细胞膜转运研究

2.4 紫杉醇脂质纳米粒口服吸收研究

3.结果与讨论

3.1 PEG修饰紫杉醇脂质纳米粒的理化性质

3.2 PEG修饰后载药SLN的转运情况

3.3 紫杉醇血样测定的方法学验证

3.4 紫杉醇脂质纳米粒的口服转运

4.小结

第六章固体脂质纳米粒对药效的影响

1.材料与仪器

2.实验方法

2.1 硬脂酸-叶酸嫁接物的合成

2.2 脂质纳米粒载体的制备

2.3 纳米粒粒径与表面电位测定

2.4 荧光标记纳米结构脂质载体的细胞摄取

2.5 紫杉醇脂质纳米粒的细胞毒性实验

2.6 耐药细胞模型评估

2.7 紫杉醇脂质纳米粒对耐药肿瘤的细胞毒性实验

3.结果与讨论

3.1 脂质纳米粒经A549细胞的摄取

3.2 紫杉醇脂质纳米粒对肿瘤细胞的毒性

4.小结

参考文献

全文结论

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致谢

作者简历

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