鸡传染性支气管炎病毒陕西地方株的分离鉴定及S1基因的克隆和序列分析

论文摘要

近几年来,传染性支气管炎（IB）在陕西各地鸡场常有发生,给养禽业生产造成了巨大的损失。为了及时、准确的掌握该疫病发生发展规律,有效地对其进行控制,本研究开展了对陕西地区鸡传染性支气管炎病原的分离鉴定等工作。采集陕西省宝鸡市、扶风县、兴平市和榆林市等地鸡场疑似传染性支气管炎发病鸡病料,通过9～11 日龄非免疫鸡胚进行了病毒的实验室分离和传代,并对分离毒株进行了病毒的血凝性、血凝抑制性、致病性、鸡胚矮小化、电镜特征等生物学特性鉴定,结果表明,4 株分离株经1%胰酶处理后的各代病毒尿囊液均可凝集鸡红细胞,标准阳性血清可特异性的抑制其凝集性,回归试验可复制出与自然发病相同的病例,病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用,透射电镜下可见有近似球形、直径100 nm左右的冠状病毒粒子,将分离鉴定的4 株IBV 定名为BJ-04、FF-04、XP-03 和YL-04。参考GenBank 中已发表的IBV 序列,针对S1 基因设计了3 条特异性引物,提取病毒RNA,用RT-PCR 方法均扩增到长约1.8kb 的特异目的片段;PCR 产物纯化回收后,与pMD18-T 载体连接,将重组质粒转化E. coli DH5a;经Amp+的培养基培养并挑出单克隆菌落;采用碱裂解法小量提取质粒,并用BamHⅠ, Hind Ⅲ双酶切法和质粒PCR 进行阳性筛选;取阳性质粒DNA进行测序。将所测定的分离株S1 基因核苷酸序列通过互联网提交到NCBI 中nucleotide-nucleotide BLAST 进行检索以及与GenBank 中注册的核苷酸序列进行比较;利用DNAStar 5.0 软件对分离株和M41、T 等已知序列毒株进行核苷酸及氨基酸序列同源性分析,绘制进化树,推测分离株与参考株之间的遗传距离;并对分离株S1 蛋白亲水性、抗原位点和糖基化位点等特性进行了理论上的分析;结合S1 基因酶切位点分析,可知在变异形式上,4 个毒株S1 基因均存在碱基的置换、插入与缺失;在进化关系上,FF-04 和XP-03 S1 基因同源性最高,亲缘关系最近;BJ-04 和YL-04 S1 基因同源性较高,亲缘关系较接近;4 个分离株S1 基因较呼吸型和肾型标准株S1 基因同源性均较低,亲缘关系较远,而且其基因型均为变异型。本研究丰富了IB分子流行病学资料,为IB 的诊断和预防奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 鸡传染性支气管炎及鸡传染性支气管炎病毒
• 1.1 概述
• 1.2 病原学
• 1.2.1 分类地位及形态特征
• 1.2.2 IBV 的一般生物学特征
• 1.3 鸡传支流行病学、临床症状、组织嗜性和病理学特征
• 1.3.1 IB 的流行病学
• 1.3.2 临床症状
• 1.3.3 组织嗜性和病理变化
• 1.4 鸡传染性支气管炎的诊断
• 1.4.1 病毒分离
• 1.4.2 血清学实验
• 1.4.3 分子生物学技术
• 1.5 传染性支气管炎病毒疫苗研究进展
• 1.5.1 弱毒疫苗
• 1.5.2 灭活疫苗
• 1.5.3 基因工程疫苗
• 1.5.4 核酸疫苗
• 1.5.5 活病毒载体疫苗
• 1.5.6 转基因植物疫苗
• 1.6 鸡传染性支气管炎的免疫预防
• 第二章 传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展
• 2.1 毒粒结构
• 2.2 基因组结构
• 2.3 病毒的复制
• 2.4 病毒RNA 转录
• 2.4.1 基因组RNA 的转录合成
• 2.4.2 负链RNA 的合成
• 2.4.3 亚基因组RNA 的合成
• 2.5 病毒基因组编码的蛋白质
• 2.5.1 结构蛋白
• 2.5.2 非结构蛋白
• 2.6 IBV 病原变异
• 2.7 IBV 分型研究进展
• 2.7.1 免疫型（或保护型）
• 2.7.2 抗原分型
• 2.8 S1基因及Sl蛋白的研究进展
• 2.8.1 S1 基因变异区与保守区
• 2.8.2 利用单抗技术对病毒进行血清分型及抗原位点分析
• 第三章 IBV陕西地方株的分离鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 病料
• 3.1.2 鸡胚及雏鸡
• 3.1.3 试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 病料处理
• 3.2.2 鸡胚接种与传代
• 3.2.3 病毒的红细胞凝集活性
• 3.2.4 鸡胚半数感染量的测定及动物回归试验
• 3.2.5 鸡胚矮小试验
• 3.2.6 电镜观察
• 3.3 结果
• 3.3.1 发病鸡群的临床表现和病理剖检变化
• 3.3.2 病原分离及鉴定
• 3.3.3 病毒分离及病毒形态
• 3.3.4 分离株的血凝特性
• 3.3.5 动物回归试验
• 3.4 讨论
• 3.4.1 病毒的分离鉴定
• 3.4.2 IBV 的血凝活性
• 3.4.3 IBV 的组织嗜性
• 3.4.4 IBV 的防制
• 3.5 小结
• 第四章 分离株S1基因克隆及序列分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 毒株
• 4.1.2 菌株、质粒载体
• 4.1.3 主要试剂及配制
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物的设计
• 4.2.2 病毒总 RNA 的提取
• 4.2.3 RT-PCR
• 4.2.4 PCR 产物的回收纯化
• 4.2.5 PCR 产物的连接
• 4.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4.2.7 转化
• 4.2.8 重组质粒的提取
• 4.2.9 重组质粒的鉴定
• 4.2.10 目的基因的序列测定
• 4.2.11 S1基因序列测定结果的鉴定
• 4.2.12 分离株S1基因的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列分析
• 4.2.13 分离株S1基因的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列系统进化关系分析
• 4.2.14 分离株S1蛋白的特性分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 引物设计
• 4.3.2 分离株S1基因的克隆及其序列
• 4.3.3 分离株S1基因的核苷酸序列测定
• 4.3.4 分离株S1基因序列测定结果的鉴定
• 4.3.5 IBV 分离株S1 基因的分析结果
• 4.3.6 分离株S1蛋白的一些特性
• 4.3.7 分离株S1基因的遗传变异分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 引物的设计
• 4.4.2 重组质粒的筛选
• 4.4.3 S1基因的酶切位点
• 4.4.4 分离株的血清型
• 4.4.5 S1与S2亚单位裂解位点
• 4.4.6 有关半胱氨酸
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介