论文摘要
过敏反应（hypersensitive response, HR）和系统获得抗性（systemic acquired resistance, SAR）是植物抗病防卫反应中的两个标志性事件。以往研究表明,多种不同来源的激发子都可以诱导植物的抗病防卫反应的启动,同时,研究也发现调控生长发育的信号通路与抗病防卫信号通路存在交叉对话,一些调控生长发育的调控因子同时也参与调控抗病防卫的调控。蛋白类激发子elicitins是由卵菌分泌的一类小分子蛋白质。这种小蛋白可以在烟草上引起类似过敏反应的坏死和系统获得抗性的产生。其中,ParA1是由寄生疫霉Phytophthra parasitica var nicotianae分泌产生的一种elicitin。对于ParA1激发子的研究表明,用ParA1蛋白注射烟草叶片,可以引起强烈的HR反应；而且,喷施叶片后,也可引起micro-HR（microscopic hypersenseitve response, micro-HR）的发生和一系列防卫反应的快速启动。利用ParA1处理烟草叶片的表皮毛,可以引起表皮毛细胞发生一系列的1nicro-HR相关反应。这表明,表皮毛内存在着一套接受外源激发子ParA1信号的分子机制。但是,ParA1是如何被植物体识别的?表皮毛是如何参与到ParA1引发的micro-HR过程之中的?另外,本实验室通过体细胞无性系变异方法产生的烟草矮化突变体表现组成性的系统获得性抗性,那么,此突变体内是否存在着同时控制营养生长和防卫的调控因子?本研究着重剖析控制生长发育的因子对过敏反应及抗病性的调控作用。1.烟草叶片表皮毛在ParA1引发HCD过程中的作用将蛋白激发子ParA1注射烟草叶片,可以引发植物过敏性细胞死亡（hypersensitve cell death, HCD）. ParA1喷施烟草叶片时,可以引发植物产生肉眼不可见的微敏反应,并伴随有活性氧迸发（ROS burst）和Chromatin condensation（Cc）的发生。表皮毛作为烟草最外部的天然屏障,势必最早接触ParA1激发子并参与其诱导的micro-HR过程。以micro-HR发生过程中的重要信号分子H202和细胞内的染色质凝集为切入点,研究了表皮毛对于ParA1激发子诱导的响应。DCFH-DA染色及荧光观察结果表明,ParA1处理后1h表皮毛内就发生活性氧迸发,这比叶肉细胞早2h,其产生的活性氧并可以向叶肉细胞传导。DAPI荧光分析表明,表皮毛内染色质凝集的发生要比叶肉细胞早5h左右。Trypan blue染色,并配合质壁分离实验,结果证明了细胞死亡在ParA1处理后1h到12h中,从表皮毛向底部细胞逐渐扩散,表皮毛细胞死亡发生比叶肉细胞早大约5h,且表皮毛在每个时间段内的细胞死亡数都高于叶肉细胞。RT-PCR方法检测了HR反应中的标志基因PAL、hin1和hsr203的表达,三个基因在ParA1处理后12h的表皮毛中都有明显表达,而在叶肉细胞内表达稍晚一些。这些结果表明,HR信号有从表皮毛向叶肉细胞中传导的趋势。2.ParA1功能缺失性突变蛋白的获得及功能验证根据以往研究,ParA1中含有6个保守的半胱氨酸,且两两结合形成三对二硫键维持着ParA1特异的空间构象。此种结构对于ParA1的功能行使是必要的。本研究主要通过点突变的方法将ParA1中的51位半胱氨酸替换为丝氨酸,得到了基因C51S,蛋白表达得到了突变蛋白C51S。通过诱导HR的功能验证发现,C51S完全丧失了在烟草叶片上诱导HR的能力。配合DAB和trypan blue染色而分别进行了活性氧和micro-HR的检测,C51S不能诱导活性氧迸发和micro-HR的产生。C51S处理表皮毛后12h,仍检测不到活性氧迸发和染色质凝集现象的发生。这些结果表明,C51S已经完全丧失了ParA1的生物功能。3. NtTTG1基因的克隆以及NtTTG1与ParA1之间的互作通过多种方式鉴定NtTTG1是与ParA1发生互作的一个蛋白。根据拟南芥中参与叶片表皮毛发育的几个关键基因序列分别设计引物,在烟草中筛选可以受ParA1诱导表达的同源物。发现只有AtTTG1的同源物的表达受诱导表达,并依此克隆到NtTTG1基因。NtTTG1在表皮毛中被ParA1的诱导表达程度明显强于叶肉细胞。在酵母双杂交中,NtTTG1与ParA1发生互作,而不与C51S发生互作。同样,NtTTG1的突变蛋白S94F也不能与ParA1发生互作。蛋白结构分析表明,51位的半胱氨酸位于ParA1蛋白的边缘,这个位置很可能在与其他蛋白的互作中起作用；由苯丙氨酸替换了NtTTG1中靠近WD40结构域的丝氨酸而得到的S94F中,丝氨酸的位置也在分子互作中起重要作用。Pull-down assay结果也证明ParA1与NtTTG1之间的物理互作。NtTTG1与ParA1之间的互作经两个蛋白在植物表皮毛中的亚细胞定位而进一步验证。融合有荧光蛋白RFP的NtTTG1在植物中的瞬时表达,这个融合基因在瞬时表达12h后在表皮毛中有大量的转录。荧光观察表明,在ParA1诱导下,NtTTG1-RFP明显的定位于表皮毛细胞的细胞膜上。荧光叠加结果表明,NtTTG1-RFP与ParA1-eGFP相结合,而与C51S-eGFP不结合,而且,这种互作发生在细胞膜附近。4.NtTTG1基因的沉默及其沉默效应检测为了进一步确认NtTTG1在激活HR信号传导中的作用,通过病毒诱导的RNA干扰机制,对NtTTG1进行沉默操作。NtTTG1基因沉默后,ParA1不能诱导NtTTG1在表皮毛和叶肉细胞中的表达,hin1基因也不能被诱导表达；表明NtTTG1是HR信号通路中的一个重要组份。与对照植株相比,RNA干扰处理植株的表皮毛和叶肉细胞发生染色质凝集和活性氧迸发的时间分别有3h和大约5h的延迟,而且,在每个时间段上,这些反应的发生程度明显减弱。因此,表皮毛在激活HR途径中先于叶肉细胞,NtTTG1起着至关重要的作用,进一步证实了叶片表皮毛在感受外源信号中的重要性。5.一种生长素抑制蛋白调控烟草矮化突变体的组成性系统获得抗性本实验室对野生型烟草（Nc89）进行体细胞无性系变异处理,得到组成性表达SAR的突变体ces1-1。与野生型相比,cesl-1表型矮化但却对真菌的侵染表现抗性。这种突变体能组成性的表达植物抗病反应基因,但是却不能表达植物生长途径中的伸展素expansin基因。回交的遗传分析表明,ces1-1是在野生型位点上的单基因显性突变。差异显示表明,在ces1-1中得到了一个与编码生长素抑制蛋白的基因NtARP1一致的转录本。通过RACE的方法克隆到NtARP1基因,并检测了生长素对基因表达的影响。基于上述研究结果,本研究对NtARP1基因进行瞬时表达,发现NtARP1定位在ces1-1的细胞核上。经过IAA处理的ces1-1,其NtARP1的表达和NtARP1蛋白产物的产生均受到抑制。我们进而对NtARP1在调控烟草的生长防卫功能上进行了研究。当突变体ces1-1中的NtARP1被沉默时,其生长恢复了野生型的表型,但是丧失了组成性表达SAR的特性。ces1-1中的IAA含量低于野生型,然而,外部施用IAA可以使ces1-1中IAA含量恢复到野生型水平。我们的实验证据表明,在突变体ces1-1中,烟草NtARP1基因编码的生长素抑制蛋白负向调控生长而正向调控防卫。本研究主要有两方面创新。第一,试验证明烟草叶片表皮毛在ParA1引发的过敏反应中起着重要的信号识别和传导作用。在烟草上克隆到了烟草表皮毛发育相关基因NtTTG1,并证明了NtTTG1与ParA1存在互作关系。进一步研究证明,NtTTG1在ParA1引发的过敏反应过程中起着重要作用,说明表皮毛发育相关因子在防卫中起着重要的调控作用。第二,试验证明了烟草生长素抑制蛋白NtARP1负调控生长而正调控抗病性,且NtARP1的表达受IAA处理的抑制。表明烟草的生长素信号通路与防卫信号通路存在交叉对话。