拟南芥BAG蛋白的GFP定位和超表达分析

论文摘要

动物体内BAG蛋白参与细胞凋亡、肿瘤发生、神经分化、应激反应和细胞周期等多种生理过程的调节,是一种辅助分子伴侣蛋白。在拟南芥基因组中有7个编码BAG蛋白的基因（AtBAGl-7）,但是目前其功能尚不清楚。本文通过GFP亚细胞定位、BAG基因突变体与超表达等方法探索了AtBAG-4和AtBAG-7在拟南芥逆境反应中功能。结果如下：AtBAG-4分布于细胞质中,与生物信息学分析的结果一致。生物信息学分析显不AtBAG-7可能分布于细胞核和内质网中,最近Brett Williams等报道了AtBAG-7在内质网中的分布。但我们的结果显示AtBAG-7也分布于细胞核中。本实验室前期的工作发现了拟南芥突变体bag4与突变体hsp70对盐胁迫敏感,并且在植物体内AtBAG-4蛋白能够与HSP70形成复合物。我们进一步分析了atbag4/hsp70双突变体,发现bag4/hsp70双突变体对盐胁迫的敏感性与hsp70单突变体相似。AtBAG-4、HSP70在拟南芥中超表达均能增强转基因植株对盐胁迫的耐受性。本实验室前期研究中发现拟南芥AtBAG-4、AtBAG-7、HSP70基因有相似的表达模式,受盐、紫外辐射、干旱、低温等多种逆胁迫的诱导。我们构建了这些基因的启动子-GUS嵌合基因表达载体,转化拟南芥,GUS活性染色的结果与过去RT-PCR得到的结果一致。AtBAG-4和AtBAG-7的表达受多因子诱导的特征与其它逆境诱导基因相似,推测该家族蛋白可能在拟南芥的逆境适应中有着重要的意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩写表
• 第一章 文献综述
• 1. BAG家族蛋白
• 1.1 BAG结构域
• 1.2 BAG蛋白的功能
• 2. 热休克蛋白家族
• 2.1 HSP70家族的基因结构及特点
• 2.2 HSP70的生物学功能
• 第二章 拟南芥BAG-4与BAG-7蛋白的细胞定位
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 质粒和菌株
• 2.2 引物设计
• 2.3 化学试剂及抗生素
• 2.4 限制性内切酶以及其他工具酶
• 2.5 基本培养基
• 2.6 常用缓冲液
• 2.7 细菌的培养及菌种保存
• 2.8 质粒DNA的制备
• 2.9 PCR扩增获得目的片段
• 2.10 PCR产物的纯化回收
• 2.11 限制性酶切
• 2.12 去磷酸化
• 2.13 平端化
• 2.14 DNA片段的连接
• 2.15 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.16 连接产物转化大肠杆菌DH5α
• 2.17 质粒的酶切和测序鉴定
• 2.18 Gateway克隆
• 2.19 Gateway克隆的鉴定
• 2.20 冻融法农杆菌感受态细胞的制备
• 2.21 农杆菌的转化
• 2.22 拟南芥的栽培
• 2.23 浸花法转化拟南芥
• 2.24 亚细胞定位的转基因阳性苗筛选
• 2.25 纯合体植株的分离
• 2.26 DAPI染色
• 2.27 荧光观测
• 3. 结果与分析
• 3.1 载体构建
• 3.2 荧光观测
• 第三章 拟南芥BAG基因的超表达分析
• 1. 前言
• 2. 实验材料与方法
• 2.1 质粒和菌株
• 2.2 引物设计
• 2.3 材料的种植及转化
• 2.4 超表达转基因阳性苗的筛选
• 2.5 超表达植株纯合体的分离
• 2.6 拟南芥DNA的提取
• 2.7 超表达植株的PCR检测
• 2.8 盐胁迫对功能缺失突变体atbag4、hsp70、atbag7及双突变体atbag4/hsp70萌发率的影响
• 2.9 盐胁迫下拟南芥突变体atbag4、hsp70、atbag7及双突变体atbag4/hsp70植株的表型分析
• 2.10 盐胁迫下拟南芥超表达植株的表型分析
• 3. 结果及分析
• 3.1 超表达植株的PCR鉴定
• 3.2 盐胁迫对拟南芥突变体种子萌发的影响
• 3.3 突变体对盐胁迫的表型分析
• 3.4 超表达植株对盐胁迫的表型分析
• 第四章 拟南芥BAG蛋白基因的诱导表达模式分析
• 1. 前言
• 2. 实验材料与方法
• 2.1 质粒和菌株
• 2.2 GUS染色液及脱色液的组成
• 2.3 材料的种植、转化、转基因阳性苗的筛选及纯合体植株的分离
• 2.4 逆境胁迫处理方法
• 2.5 GUS基因的瞬时表达检测
• 2.6 引物设计
• 2.7 PCR扩增
• 2.8 PCR回收及纯化
• 2.9 限制性酶切
• 2.10 Gateway克隆
• 3. 实验结果
• 3.1 载体的构建
• 3.2 AtHSP70、AtBAG-4、AtBAG-7的表达受盐胁迫诱导
• 3.3 紫外UVB胁迫诱导AtHSP70、AtBAG-4、AtBAG-7的表达
• 3.4 干旱诱导AtHSP70、AtBAG-4、AtBAG-7的表达
• 3.5 低温诱导AtHSP70、AtBAG-4、AtBAG-7的表达
• 第五章 讨论
• 参考文献
• 致谢