人TIRAP结构域TIR的克隆、表达、纯化及三维结构模型构建

论文摘要

TIRAP（TIR domain-containing adaptor protein）也叫Mal（MyD88-like adaptor）是继Myd88之后发现的又一个含有TIR结构域的适配蛋白。这个蛋白是在依赖Myd88途径中，即TLR2和TLR4的部分信号通路，起适配子的作用。TIRAP在TLR家族信号转导中具有突出的重要性和复杂性。TIRAP能够发挥这些作用的原因是因为它含有一个关键的结构域，即TIR结构域。在先天免疫系统中，TLRs与配体分子结合后，再通过TIR-TIR的相互作用而将信号传递给适配蛋白，再依次将信号传递给下游的蛋白。因此在病原入侵的早期阶段先天免疫系统发挥作用的过程中，TIR结构域起着关键的作用。本研究从TIRAP入手，通过制备大肠杆菌超级感受态细胞、获得TIRAPd序列、设计引物、进行PCR扩增，构建表达载体，进而对重组质粒进行诱导表达和纯化，获得了高纯度、高量和稳定的人TIRAP结构域TIR蛋白，并对TIRAP中TIR结构域的三维模建，主要结果如下：（1）将TIRAP结构域TIR成功地重组到pET15b表达载体。（2）通过试验探讨温度对重组子pET15b-TIRAPd转化E．coli Rosetta（DE3）表达的影响，结果表明其适宜的表达温度为30℃。（3）TIRAPd在E．coli Rosetta（DE3）高效表达，得到了较多的可溶蛋白组分。（4）经过亲和柱和分子筛纯化得到了较高的纯度TIRAPd，简化了纯化步骤，减少了蛋白损失。（5）依据TLR2的TIR结构，成功地构建了TIRAP的TIR三维结构模型，为TIRAP进一步的功能和结构研究打下了基础。TIRAPd在原核中成功的表达降低了实验的成本，且比真核细胞表达更快捷，因此具有更广泛的应用价值。以此为突破口，逐步地阐述一些未知的问题。如果TIRAP能够研究很透彻的话，不仅具有重要的理论意义，而且在未来免疫系统疾病的治疗，和药物设计等都具有广阔的应用价值。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中方摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 研究综述
• 1.1 天然免疫系统概述
• 1.2 Toll样受体
• 1.2.1 Toll的发现
• 1.2.2 Toll/IL-1R家族的来源
• 1.2.3 Toll样受体的家族成员、结构特点及其特异配体
• 1.2.4 TLRs之间及TLRs和辅助蛋白之间的互作
• 1.3 TLRs介导的信号途径
• 1.3.1 依赖Myd88型信号通路
• 1.3.2 不依赖Myd88型/依赖TRIF信号通路
• 1.4 TIR结构域在TLRs介导信号途径中的重要作用
• 1.5 TIRAP
• 1.6 本课题的意义和目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 TIRAP基因、菌种及质粒
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方案设计与优化
• 2.2.1 TIRAPd的PCR扩增与pET15b—TIRAPd重组质粒的鉴定
• 2.2.2 TIRAPd的诱导表达和纯化
• 2.2.3 TIRAP结构域TIR的三维模建
• 2.3 方法
• 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.2 TIRAPd序列的确定
• 2.3.3 引物设计和PCR扩增
• 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳分析
• 2.3.5 核酸回收
• 2.3.6 酶切回收产物和表达载体pET15b
• 2.3.7 连接
• 2.3.8 转化和筛选
• 2.3.9 碱裂解—中和法提取质粒
• 2.3.10 重组质粒的酶切分析
• 2.3.11 序
• 2.3.12 重组质粒的诱导表达
• 2.3.13 SDS—PAGE电泳
• 2.3.14 菌体超声破碎
• 2.3.15 蛋白的镍亲和柱纯化
• 2.3.16 蛋白的分子筛纯化
• 2.3.17 TIRAP中TIR结构域的三维模建
• 3 结果与分析
• 3.1 TIRAPd的基因序列和TIR结构域蛋白序列预测
• 3.2 TIRAPd的PCR扩增
• 3.3 pET15b—TIRAPd重组质粒的酶切鉴定
• 3.4 pET15b—TIRAPd重组质粒的测序
• 3.5 TIRAPd的诱导表达和温度对表达的影响
• 3.6 TIRAPd的镍亲和柱纯化
• 3.7 TIRAPd分子筛纯化
• 3.8 TIRAP蛋白TIR结构域的三维模型及其分析
• 4 讨论
• 4.1 表达菌株的选择
• 4.2 表达载体的选择
• 4.3 蛋白质的稳定性
• 4.4 TIRAP中TIR结构域的三维模型的构建
• 4.5 TIRAP与其它蛋白相互作用的初步研究
• 5 小结与展望
• 参考文献
• 附录一 常用生化试剂的配制
• 附录二 SDS-PAGE所需的缓冲液
• 附录三 蛋白的镍亲和柱纯化所需的缓冲液及再生方法
• 附录四 分子筛纯化所需的缓冲液
• 致谢