牛凝乳酶原基因的定点突变与酶性质研究

论文摘要

凝乳酶是酸性蛋白酶,它是组成皱胃酶的一种主要成分,在反刍动物的第四胃产生凝乳酶原,主要是水解Κ-酪蛋白的Phe 105-Met 106键。凝乳酶在奶酪加工中应用广泛,在奶酪生产过程中,它起着凝结牛乳、改善风味的作用。为获得高活性的凝乳酶制剂,本研究通过PCR技术从克隆载pUC18-preprochymosin上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pKLAC1中,构建表达质粒pKLAC1-prochymosin,通过电脉冲法将线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中,乳酸克鲁维酵母GG799菌株非常适合于牛凝乳酶基因的表达。通过含1%酪蛋白的YEPD平板活性筛选,PCR鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌pc 7-7。该菌株分泌表达牛凝乳酶原,经SDS-PAGE分析,证明重组牛凝乳酶原的分子量约为41 kDa,符合预期大小,酸化处理后为36 kDa,证明可以正确自我剪切。液体培养96 h后,酶活最高达到99.67 SU/mL,这为后续的研究提供了基础。该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件,并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础。采用定点突变的方法来改变凝乳酶基因的碱基,此方法是依据定点突变试剂盒的方法改良而来,抽提含有凝乳酶基因的质粒载体pKLAC1-prochymosin,体外合成突变引物,利用高保真Pyrobest DNA聚合酶对质粒DNA进行PCR突变反应,然后用DpnⅠ限制性内切酶消化PCR产物以去除模板DNA,将消化产物转化大肠杆菌JM109,随机挑选克隆进行测序和筛选、鉴定所需突变株。通过YCB和YEPDL培养基的筛选,筛选出了五个适合的突变体菌株。我们可以发现,所有的突变体都可以产生凝乳酶,但是突变体所产凝乳酶的活性较重组菌株的酶活性低,这表明此位点的改变可能对凝乳酶的折叠影响较小,但是对催化活性的影响较大。通过结构分析发现本研究所克隆出的凝乳酶为B型,判断的标准为成熟凝乳酶在224位的氨基酸,A型凝乳酶在224位的氨基酸为天冬氨酸,B型凝乳酶在224位的氨基酸为甘氨酸。氨基酸位点的改变对B型凝乳酶的活性影响较大,突变体mpc 3-7的333位氨基酸由天冬酰胺变为亮氨酸,334位的组氨酸变为异亮氨酸,从而导致酶活性的下降,而且突变体mpc 3-7的最适温度由55℃下降到50℃。说明凝乳酶的333位和334位的氨基酸的改变会影响酶的活性和热稳定性,但是对酸碱的敏感性没有改变。发酵液通过50%乙醇沉淀,Sephadex G-75分子筛层析和DEAE-52纤维素离子交换层析进行分离纯化,纯化后经SDS-PAGE电泳鉴定为单一的条带,已经达到电泳纯。重组凝乳酶和突变体所产凝乳酶在DEAE-52上的行为基本一致。重组菌株pc 7-7的比活力从粗酶液的114.56 U/mg提高到1609.66 U/mg,突变体菌株mpc 2-1a的比活力从粗酶液的54.2 U/mg提高到724.57 U/mg,突变体菌株mpc 3-7的比活力从粗酶液的37.05 U/mg提高到566.29 U/mg,各菌株都取得了较好的的纯化效果。通过对酶性质的研究发现,重组菌株pc 7-7的最适反应温度范围为30-55℃,最适pH范围为4.0-5.5,其Km和Vmax分别是0.02 mg/ml和0.0214 mg/ml.min;突变菌株mpc 2-1a的最适pH为4.5,最适温度为55℃,在此条件下,酶活性能达到最高;其Km和Vmax分别是0.0122 mg/ml和0.002 mg/ml.min;突变菌株mpc 3-7的最适pH与重组菌株相同,最适反应温度为50℃,比正常菌株pc 7-7和突变体菌株mpc 2-1a的温度有所下降,其Km和Vmax分别是0.003 mg/ml和0.0005 mg/ml.min。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词
• 第一章 前言
• 1.1 干酪的营养价值和发展前景
• 1.2 凝乳酶的结构及其凝乳机理
• 1.2.1 凝乳酶的结构
• 1.2.2 凝乳酶的凝乳作用
• 1.3 凝乳酶替代品
• 1.4 重组凝乳酶的原核表达
• 1.5 重组凝乳酶的真核表达
• 1.6 本项试验研究的内容和意义
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和载体
• 2.1.2 主要工具酶和仪器
• 2.1.3 试剂和培养基
• 2.1.4 培养基配方
• 2.1.5 主要缓冲液配方
• 2.1.6 蛋白质电泳试剂
• 2.1.7 PCR 引物
• 2.2 重组质粒构建的方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 目的基因的PCR 扩增
• 2.2.3 PCR 产物纯化
• 2.2.4 DNA 片段和载体的连接
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.6 质粒DNA 的转化
• 2.2.7 菌液PCR
• 2.2.8 质粒DNA 的提取
• 2.2.9 双酶切鉴定重组载体
• 2.3 凝乳酶基因定点突变的方法
• 2.3.1 凝乳酶基因定点突变的引物设计
• 2.3.2 凝乳酶基因定点突变的PCR 反应
• 2.3.3 突变体的验证
• 2.4 凝乳酶基因的表达
• 2.4.1 重组质粒pKLAC1-Prochy 的构建
• 2.4.2 线性化质粒DNA 制备
• 2.4.3 乳酸克鲁维酵母感受态细胞的制备
• 2.4.4 酵母电转化
• 2.4.5 重组子的筛选
• 2.4.6 酶活性的测定
• 2.5 表达产物的SDS-PAGE 电泳检测
• 2.5.1 SDS-PAGE 凝胶的灌制
• 2.5.2 加入样品
• 2.5.3 电泳
• 2.5.4 凝胶的染色及脱色
• 2.5.5 蛋白质含量的测定
• 2.6 凝乳酶纯化的方法
• 2.6.1 样品预处理
• 2.6.2 柱料处理
• 2.6.3 装柱
• 2.6.4 离子交换层析
• 2.6.5 凝胶过滤层析
• 2.7 酶促反应动力学
• 2.8 温度和pH 对酶活性的影响
• 第三章 实验结果与分析
• 3.1 重组菌株的构建
• 3.1.1 酵母表达载体的构建
• 3.1.2 重组菌株的构建
• 3.2 定点突变的结果分析
• 3.3 凝乳酶的纯化
• 3.3.1 层析结果
• 3.3.2 纯化分离效果
• 3.3.3 重组菌株表达产物的SDS-PAGE 电泳分析
• 3.3.4 凝乳酶Km 和Vmax 的测定
• 3.4 凝乳酶的最适反应温度和pH
• 3.5 讨论
• 3.6 研究总结
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文