论文摘要
精子发生是在睾丸生精小管中进行的连续的、复杂的细胞分裂分化过程,该过程受到睾丸内外多种因素的精确调控。若内外环境失调,这个严密过程将出现不同程度的紊乱,进而导致不育。精子发生相关蛋白在精子发生的多个阶段进行不同程度的表达,在基因、蛋白、细胞等水平上对整个生精过程进行统筹的调节。若能掌握这些相关因子的功能,将有助于我们了解精子发生的分子调控机理,从而有针对性地解决临床上男性不育症问题以及为发展男性避孕方法提供新的思路。精子发生对睾丸外环境的温度十分敏感,升高局部温度会导致睾丸可逆性的生精障碍。因此,热作用处理的睾丸有助于我们建立研究精子发生相关蛋白的良好模型。在前期工作中,本实验室利用双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）和质谱（mass spectrometry,MS）分别分离和鉴定小鼠及人睾丸热作用后不同时间点表达发生改变的蛋白质,并构建了相应的丰度发生显著改变的差异表达谱。这两个谱系中均鉴定到核内不均一核糖核蛋白H（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H,在小鼠为Hnrnph1,在人类为其高度同源的蛋白HNRNPH1）。Hnrnph1是一种RNA结合蛋白,属于hnRNPs超家族的亚家族hnRNP H家族,进化上相对保守,在不同的生物事件中发挥重要作用。在小鼠及人睾丸热作用相关蛋白表达谱中这两个蛋白显示了相同的表达趋势,即在生精破坏时其表达下降,在生精功能恢复时其表达升高。这一结果提示Hnrnph1/HNRNPH1可能参与调控精子发生。本研究中,我们对Hnrnph1蛋白在精子发生中的作用及其机制进行了探讨。我们首先检测了Hnrnph1蛋白在睾丸中的表达与细胞定位。应用商业化Hnrnph1抗体行Western blot检测,显示Hnrnph1蛋白在成年小鼠以及人睾丸中特异表达。接着应用该抗体对产后0天、1周、2周、3周、4周的发育中小鼠睾丸,成年小鼠睾丸以及成人睾丸行免疫组化检测,结果显示:在小鼠睾丸及成人睾丸中,Hnrnph1主要表达于精母细胞核,在间质细胞及支持细胞胞浆亦有表达。小鼠睾丸组织免疫荧光及分离各级生精细胞免疫荧光的结果与免疫组化一致。进一步,我们以小鼠精母细胞系（GC2-spd）为体外实验平台探讨Hnrnph1的功能,主要进行了以下研究:（1）首先运用Western blot方法,在蛋白水平验证GC2-spd中有Hnrnph1表达。接着,免疫荧光显示Hnrnph1主要表达于精母细胞系细胞核。（2）检测GC2-spd中Hnrnph1表达水平与细胞凋亡的相关性。我们用热作用方法诱导细胞凋亡,然后检测细胞中Hnrnph1的表达水平,以揭示其是否与凋亡相关。GC2-spd在42℃加热孵育3h后恢复至37℃培养,分别在复温后0h、3h、6h、24h取细胞进行检测,未加热GC2-spd作为对照组。每组细胞一部分通过AV-FITC结合PI标记流式检测凋亡,另一部分抽提细胞蛋白Western blot检测Hnrnph1表达水平。结果显示:热作用后复温24h细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）;而此时Hnrnph1的表达量显著低于对照组（P<0.05）。这一结果提示, Hnrnph1与GC2细胞凋亡相关,可能参与调控细胞凋亡过程。（3）抑制GC2-spd中Hnrnph1的表达后检测其对细胞凋亡的影响。我们利用RNAi技术,将干涉质粒转染GC2-spd,构建干涉Hnrnph1表达的稳定细胞系。在实验范围内,由于热作用后复温24hGC2-spd细胞系凋亡最显著,因此我们检测了未热作用及热作用后复温24h时干涉组和无关对照组的凋亡率。结果显示:未热作用组干涉细胞系凋亡率显著高于无关组（P<0.01）,热作用组干涉细胞系凋亡率显著高于无关组（P<0.01）。结合相关性研究,提示Hnrnph1蛋白具有抗凋亡作用。且此结果与我们在前期睾丸加热研究中观察到的生精破坏时该蛋白表达下降、而生精恢复时该蛋白表达升高的表达特点相符。（4）探讨Hnrnph1拮抗细胞凋亡的分子通路。运用蛋白质组学的方法,分离和鉴定GC2-spd细胞系在干涉Hnrnph1后表达丰度发生显著变化的蛋白质,它们可以用来描述Hnrnph1参与调控的分子通路。结果显示:较之对照组,干涉组中有72个蛋白点表达发生改变,其中27个蛋白点表达下降,45个蛋白点表达升高。72个蛋白点对应于66种蛋白,其中31种蛋白已有文献报道参与调控细胞的增殖、凋亡,直接参与细胞凋亡信号传导通路的蛋白有9种（Clic4/Gmfb/Hspa5/Park7/Cfl1/Sod2/Eef2/Numa1/PICOT）,其中Clic4/Gmfb/ Hspa5/Park7/Cfl1/Sod2/Eef2/Numa1参与了经典的线粒体凋亡通路。参与增殖调控的蛋白有14种（Arl3/Calu/Des/Dstn/ENO1/Fkbp52/Glo1/Naca/Pkm2/Pgk1/Psat1/ Rpsa/Set/Tubb）。另外21种蛋白质或与细胞周期有关,或参与细胞骨架形成,或与RNA翻译、加工有关,还有的与应激保护有关。Hnrnph1蛋白通过影响这些蛋白质的表达,调控细胞凋亡。综上所述,在体外,Hnrnph1蛋白是精母细胞系凋亡的负调控因子,结合细胞系体外实验的一系列结果,我们推断Hnrnph1是精子发生过程中一种拮抗生精细胞凋亡的保护性蛋白。它在精子发生中可能是通过直接或间接的作用,拮抗生精细胞凋亡,与众多因子协同作用促进精子发生正常有序进行。