以HCMVUL54为靶基因构建M1GS真核表达载体及两个M1GS体内活性的检测

论文摘要

源自大肠杆菌的RNase P是促使ptRNA 5’端成熟的天然核酶。其催化核心RNA亚单位（M1 RNA）能在缺乏辅助单位C5蛋白情况下,发挥切割作用。RNaseP是结构识别酶,能与mRNA形成RNase P识别的底物形式的小片段RNA称为外部引导序列EGS（Extemal guide sequence）。EGS共价连接到M1RNA的3’末端成为附属于M1RNA的一段引导序列,称为GS。附带GS的M1RNA成为具备自我引导和序列特异切割能力的核酶-M1GS。 人巨细胞病毒DNA聚合酶催化亚单位—UL54,是人巨细胞病毒（HCMV）复制的关键酶。许多HCMV耐药株与该基因点突变相关。因此干扰UL54基因,能抑制HCMV的繁殖以及提高给药治疗效果。 本实验根据陈浩军硕士的体外切割实验,选用具有切割作用的两个核酶T4-M1GS和T7-M1GS构建在携带U6启动子的逆转录病毒载体上,使其在Hela细胞内具备转录能力,研究其对构建在真核载体pZGFP-N1的UL54片段表达的RNA的切割作用,为进一步研究以RNase P为基础的反义RNA技术抑制病毒基因表达奠定基础。 本论文进行了下列实验: T4-M1GS和T7-M1GS分别构建于携带U6启动子的逆转录病毒载体pLXSN上,命名为T4-M1GS-pLXSN和T7-M1GS-pLXSN。 T4-M1GS-pLXSN和T7-M1GS-pLXSN分别与空载体pEGFP-N1共转染Hela细胞,结果显示这两个核酶对报告基因GFP不产生干扰作用。 核酶重组质粒T4-M1GS-pLXSN和底物重组质粒UL54-C-GFP共转染Hela细胞,实验表明核酶T4-M1GS能作用于UL54-C-GFP的RNA片段。进一步将UL54-CD-GFP转染至T4-M1GS-pLXSN稳定表达的Hela细胞中,Northern blot结果表明在Hela细胞中稳定表达的T4-M1GS能切割绝大部分底物UL54-CD。 具有最高体外切割活性的T7-M1GS-pLXSN和底物UL54-CD-GFP共转染Hela细胞,Northern blot结果显示此核酶在细胞水平上仍具有对底物很高的切割作用。 研究结果表明,体外实验筛选到的高切割活性的核酶在细胞内也具有较强的

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一 前言
• 1.核酶的发现及分类
• 2.RNase P作为分子剪刀的历史以及设计原则
• 3.M1GS在细胞内稳定，分布和表达
• 4.M1GS技术的优点
• 5.HCMV简介
• 6.课题意义
• 二 材料和方法
• 1 主要仪器设备
• 2 材料
• 2.1 细胞株
• 2.2 质粒和菌株
• 2.3 引物和测序
• 2.4 主要试剂和试剂盒
• 2.5 培养基的配制
• 2.5.1 细菌培养基的配置
• 2.5.2 细胞培养基的配置
• 2.5.3 血清的处理
• 2.6 其他常用试剂的配置
• 2.6.1 质粒DNA提取及纯化所需试剂
• 2.6.2 细胞培养常用试剂的配制
• 2.6.3 琼脂糖凝胶电泳所需溶液
• 2.6.4 所需抗生素的配置
• 2.6.5 Northern blot杂交所用试剂配置
• 3 实验路线及方法
• 3.1 核酶T4-M1GS和T7-M1GS的克隆
• 3.1.1 核酶M1GS克隆技术路线
• 3.1.2 核酶T4-M1GS和T7-M1GS两端引物的设计
• 3.1.3 PCR扩增核酶基因
• 3.1.4 凝胶回收纯化
• 3.1.5 载体pLXSN的制备
• 3.1.6 插入片段（核酶T4-M1GS和T7-M1GS PCR片段）和载体（pLXSN）的双酶切、连接
• 3.1.7 制备感受态
• 3.1.8 转化
• 3.1.9 碱裂解法抽提质粒验证
• 3.2 底物片段的克隆
• 3.2.1 底物片段克隆技术路线
• 3.2.2 底物片段54-C和54-D两端引物的设计
• 3.2.3 PCR扩增（54-C，54-D，54-CD）
• 3.2.4 凝胶回收纯化
• 3.2.5 载体pEGFP-N1的制备
• 3.2.6 插入片段（核酶PCR片段）和载体（pEGFP-N1）的双酶切、连接
• 3.2.7 制备感受态
• 3.2.8 转化
• 3.2.9 快速抽提法抽提质粒验证
• 3.3 细胞复苏和细胞冻存
• 3.4 检测Hela细胞耐受G418的临界值
• 3.5 细胞转染，G418筛选
• 3.5.1 转染试剂为Lipofectamine和Plus共用的转染方案
• 3.5.2 转染试剂为Lipofectamine 2000的转染方案
• 3.6 基因组的抽提、鉴定
• 3.7 RNA的抽提
• 3.8 RT-PCR
• 3.9 Northern blot
• 三 结果与分析
• 1.pLXSN质粒扩增，测序，确定U6启动子的存在及MCS位点
• 2.扩增T4-M1GS，T7-M1GS的DNA片段，克隆至pLXSN载体上，鉴定
• 3.扩增底物UL54-C，UL54-D，UL54-CD的DNA片段，克隆至pEGFP载体上，鉴定
• 4.核酶重组质粒和pEGFP-N1质粒共转染Hela细胞，荧光显微镜检测
• 5.核酶重组质粒T4-M1GS-pLXSN和底物重组质粒UL54-C-GFP共转染Hela细胞中，荧光显微镜检测
• 6.将底物重组质粒UL54-CD-GFP转染核酶T4-M1GS稳定表达的Hela细胞中，Northern blot检测
• 7.核酶重组质粒T7-M1GS-pLXSN与底物重组质粒UL54-CD-GFP共转染Hela细胞，Northern blot检测
• 四 讨论
• 1.关于M1GS的可能用途
• 2.M1GS的不足
• 3.使用具有报告基团的载体所注意的事项
• 五 结论
• 附录
• 附录1 U6-pLXSN测序结果
• 附录2 NCBI上的U6 snRNA序列
• 附录3 T4-M1GS-pLXSN测序序列
• 附录4 T7-M1GS-pLXSN测序序列
• 附录5 UL54基因全长测序结果（序列）
• 附录6 pEGFP-N1载体测序结果
• 参考文献
• 致谢