氯霉素人工抗原的合成及活性检测的研究

论文摘要

氯霉素（chloramphenicol,CAP）是第一个人工合成的广谱抗生素,由于其效高价廉,曾被广泛地应用于临床,家畜和水产养殖。随着对CAP的深入研究,人们发现其有严重的毒副作用,在机体中即便是微量的残留也可对人类的健康构成直接或潜在的威胁。为了控制CAP的滥用,亟待建立一种快速,灵敏,方便的CAP残留检测方法。酶联免疫法（ELISA）由于其灵敏、特异、操作简便以及便于推广的特点非常适用于CAP的检测,而有效的CAP人工抗原与抗体的制备,则是免疫分析的关键所在。本实验对CAP人工抗原的合成,多克隆抗体的制备,CAP-ELIS A检测方法的建立进行了研究。采用重氮化法、混合酸酐法、碳二亚胺法将CAP与BSA偶联合成人工抗原CAP-BSA（CAP-HS-BSA）,用紫外全波段扫描与SDS-PAGE电泳判断CAP人工抗原合成成功,纯度达到电泳纯。同时,设计正交实验考察了配料比、反应温度和偶联pH等相关因素对结合比的影响,建立了最佳反应条件。优化后三种方法制得的CAP-BSA（CAP-HS-BSA）最高结合比分别达到55.3,15.7,24.6。分别以重氮化法、混合酸酐法和碳二亚胺法3种方法合成的6种抗原免疫Balb/C小鼠,得到不同的CAP血清多克隆抗体。经测定,用重氮化法合成的CAP-BSA样品（结合比为55.3）免疫小鼠制备的血清抗体效价最高,达128,000。对间接ELISA法的实验条件进行了考查,确定了以下最佳条件:CAP血清多克隆抗体的最佳稀释倍数为16,000倍,CAP-OVA的最佳包被浓度为1μg/mL,封闭液为1%的OVA,包被温度与时间为4℃过夜,一抗和酶标二抗的最佳作用时间都为1.5h,底物显色的最佳时间为5min。建立了 CAP抗体的竞争抑制曲线:y=-20.212x+61.811,R2=0.9769,检测限为 0.04ng/mL,IC50=3.84ng/mL。CAP 浓度在0.5ng/mL-100ng/mL之间时,线性较好。测试了该CAP抗体与其它抗生素（甲砜霉素、氟苯尼考、青霉素、链霉素等）的交叉反应,结果证明该CAP抗体特异性良好。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 氯霉素简介
• 1.1.1 氯霉素的理化性质
• 1.1.2 氯霉素的作用机理
• 1.2 氯霉素的应用范围
• 1.3 氯霉素的药代动力学
• 1.4 氯霉素药物的毒副作用
• 1.4.1 氯霉素对造血系统的影响
• 1.4.2 氯霉素引起的其它不良反应
• 1.5 各国对氯霉素残留的规定
• 1.6 氯霉素残留的现状
• 1.7 氯霉素检测进展
• 1.7.1 微生物测定法
• 1.7.2 色谱法
• 1.7.3 免疫分析法
• 1.8 本课题研究的目的与意义
• 1.9 本课题研究的内容
• 第二章 氯霉素人工抗原的合成与鉴定
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要溶液配制
• 2.2 标准曲线的建立
• 2.2.1 BSA标准曲线
• 2.2.2 OVA标准曲线
• 2.2.3 CAP标准曲线
• 2.2.4 CAP-HS-Na标准曲线
• 2.2.5 BSA考马斯亮蓝法标准曲线
• 2.2.6 OVA考马斯亮蓝法标准曲线
• 2.3 重氮化法合成氯霉素人工抗原
• 2.3.1 反应流程图
• 2.3.2 反应步骤及条件的优化
• 2.4 混合酸酐法合成氯霉素人工抗原
• 2.4.1 反应流程图
• 2.4.2 反应步骤及条件的优化
• 2.5 碳二亚胺法合成氯霉素人工抗原
• 2.5.1 反应流程图
• 2.5.2 反应步骤及条件的优化
• 2.6 氯霉素人工抗原的鉴定
• 2.6.1 紫外分光光度法鉴定人工抗原
• 2.6.2 SDS-PAGE电泳法鉴定人工抗原
• 2.7 结果与分析
• 2.7.1 人工抗原的紫外扫描结果
• 2.7.2 人工抗原的电泳鉴定结果
• 2.7.3 人工抗原的偶联条件优化结果
• 2.8 本章小结
• 第三章 氯霉素多克隆抗体的制备与ELISA的建立
• 3.1 实验试剂与仪器
• 3.1.1 实验试剂与材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 ELISA相关试剂配置
• 3.2 抗氯霉素多克隆抗体的制备
• 3.3 间接ELISA法的建立
• 3.3.1 测定血清抗体效价
• 3.3.2 血清抗体最佳稀释倍数的确定
• 3.3.3 包被抗原的最佳浓度
• 3.3.4 包被温度与时间的优化
• 3.3.5 封闭液的选择
• 3.3.6 一抗作用时间的优化
• 3.3.7 酶标二抗作用时间的优化
• 3.3.8 底物显色时间的优化
• 3.3.9 建立抗体的竞争抑制曲线
• 3.3.10 交叉反应率
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 血清抗体效价
• 3.4.2 血清抗体最佳稀释倍数
• 3.4.3 包被抗原的最佳浓度
• 3.4.4 包被温度与时间的优化结果
• 3.4.5 封闭液的选择
• 3.4.6 一抗作用时间优化结果
• 3.4.7 酶标二抗作用时间优化结果
• 3.4.8 底物作用时间优化结果
• 3.4.9 抗体的竞争抑制曲线的建立
• 3.4.10 交叉反应率
• 3.5 本章小结
• 第四章 讨论
• 4.1 人工抗原合成方法的选择
• 4.2 载体蛋白的选择
• 4.3 免疫条件的选择
• 4.4 ELISA方法的探讨
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文