屎肠球菌和粪肠球菌酪氨酸脱羧酶的基因克隆、表达及活性研究

论文摘要

屎肠球菌（Enterococcus faecium）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是两种最常见的产酪胺微生物,在已有的研究中,这两种菌体均具有很强的产酪胺能力。本试验所用的两株菌均是从南京传统食物——盐水鸭中分离出来的产酪胺能力较强的两株菌,通过对两株菌酪氨酸脱羧酶基因以及相应酶的研究,对两个酪氨酸脱羧酶有了更深入的了解。首先对两株产酪胺菌进行了鉴定,确定了两株菌分别属于屎肠球菌和粪肠球菌。同时对两株菌的酪氨酸脱羧酶基因进行了扩增并测序,得到了两株菌酪氨酸脱羧酶基因序列,粪肠球菌R612Z1酪氨酸脱羧酶基因含有1921 bp个碱基,屎肠球菌R615Z1酪氨酸脱羧酶基因含有2006 bp个碱基。通过对比两个酪氨酸脱羧酶基因序列和氨基酸序列,发现两者在序列结构上有很高的相似性,同时也发现位于蛋白结构上的磷酸吡哆醛结合位点,说明了两个酶均为磷酸吡哆醛依赖型脱羧酶。其次利用扩增出的酪氨酸脱羧酶基因构建了相应的表达载体,并对外源表达蛋白进行了SDS-PAGE电泳分析和活性鉴定,得出两个蛋白分子量约为70 kDa,并且两个酶均对两种底物氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）菌具有催化活性。最后对两个酪氨酸脱羧酶的米氏常数、Vm值、最适pH、最适温度等进行了研究,同时也研究了NaCl浓度对酶活性的影响。最后发现612TDC Kmt=0.021 mol·L-1, Vmax’=2.088 mol·L-1·min-1,最适底物为酪氨酸,最适温度为25℃,最适pH为6.0；而615TDCKmp=0.019 mol·L1, Vmaxp=0.314 mol·L1·min-1,最适底物为苯丙氨酸,最适温度为25℃,最适pH为5.5。NaCl浓度对酶催化酪氨酸的活性影响不大,但是对两个酶催化苯丙氨酸的活性均有很强的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 生物胺与食品安全
• 1.1.1 生物胺简介
• 1.1.2 生物胺的生理作用和毒性
• 1.1.3 生物胺的食品来源
• 1.1.4 生物胺的微生物来源
• 1.2 聚合酶链反应（PCR）技术在生物胺检测中的应用
• 1.3 高效液相色谱（HPLC）技术在生物胺检测中的应用
• 1.4 酪胺及酪氨酸脱羧酶的进展及展望
• 1.5 本课题研究的目的和意义
• 1.6 本课题研究的主要内容
• 第二章 屎肠球菌和粪肠球菌酪氨酸脱羧酶基因的测序分析
• 2.1 实验材料、试剂和仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 两株产酪胺肠球菌的培养及细菌总DNA的提取
• 2.2.2 细菌16S rRNA V3可变区PCR扩增
• 2.2.3 屎肠球菌和粪肠球菌酪氨酸脱羧酶基因的PCR扩增
• 2.2.4 两个菌酪氨酸脱羧酶基因系统发育分析及生物信息学分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 两株肠球菌16S rRNA测序结果
• 2.3.2 两株肠球菌酪氨酸脱羧酶基因（TDC）的扩增
• 2.3.3 两个酪氨酸脱羧酶氨基酸序列比对
• 2.4 小结
• 第三章 屎肠球菌和粪肠球菌酪氨酸脱羧酶的克隆表达、纯化及产物鉴定
• 3.1 实验材料、试剂和仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 酪氨酸脱羧酶基因克隆载体和表达载体的构建
• 3.2.2 酪氨酸脱羧酶基因的诱导表达
• 3.2.3 表达蛋白的分离纯化
• 3.2.4 外源表达产物催化活性鉴定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 612TDC克隆载体的构建
• 3.3.2 612TDC克隆载体的双酶切验证
• 3.3.3 612TDC表达载体的构建
• 3.3.4 612TDC表达载体的双酶切验证
• 3.3.5 615TDC克隆载体的构建
• 3.3.6 615TDC克隆载体的双酶切验证
• 3.3.7 615TDC表达载体的构建
• 3.3.8 615TDC表达载体的双酶切验证
• 3.3.9 612TDC在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.3.10 615TDC在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.3.11 表达蛋白612TDC和615TDC的分离纯化
• 3.3.12 不同生物胺标准样品TLC检测结果
• 3.3.13 表达蛋白催化活性的TLC检测结果
• 3.4 小结
• 第四章 外源表达酪氨酸脱羧酶的酶学性质及动力学研究
• 4.1 实验材料、试剂和仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 生物胺的HPLC测定方法
• 4.2.2 两株菌酪氨酸脱羧酶酶学性质研究
• 4.2.3 两株菌酪氨酸脱羧酶动力学研究
• 4.2.4 NaCl对酶活力的影响
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 HPLC对生物胺标准样品的定性分析
• 4.3.2 生物胺标准样品的回归方程、相关系数及检测限
• 4.3.3 pH对外源表达酪氨酸脱羧酶活性的影响
• 4.3.4 温度对外源表达酪氨酸脱羧酶活性的影响
• 4.3.5 外源表达酪氨酸脱羧酶动力学常数的测定结果
• 4.3.6 NaCl浓度对外源表达酪氨酸脱羧酶活性的影响
• 4.4 小结
• 全文总结
• 附录1
• 附录2
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢