血红蛋白与活性氮氧化合物相互作用及其类酶催化机理的研究

论文题目: 血红蛋白与活性氮氧化合物相互作用及其类酶催化机理的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 李得加

导师: 邹国林

关键词: 血红蛋白,过氧亚硝基阴离子,中间体,类酶催化,反应机理

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 血红蛋白（Hb）是血红细胞中的一种主要的血红素蛋白,在体内担负着O2和CO2的转运等功能。除此之外,Hb还具有多种酶活性。本文研究了Hb催化H2O2氧化邻苯二胺（OPDA）反应中间体的特性。用动态快速停留光谱仪跟踪反应,可以捕捉到中间体的吸收峰。在水-正丁醇二相体系中提纯得到稳定的中间体,并证实此中间体在710nm处的吸收峰是与OPDA相关的中间体的吸收峰,在-10℃下中间体的半衰期为一个星期。用紫外-可见光谱、红外光谱和质谱对中间体和产物进行了表征。结果表明产物是2,3-二氨基吩嗪,中间体是比产物多两个氢原子的吩嗪类化合物,分析了中间体的结构并对其进行了命名。结合辣根过氧化物酶（HRP）的催化反应机理和我们的实验结果,提出了一种可信的Hb催化H2O2氧化OPDA的反应机理。 研究了Hb活性中心金属离子对其酶活性的影响。将Mn-原卟啉Ⅸ与脱辅基Hb重组得到Mn取代Fe的重组Hb,用紫外-可见光谱法和SDS-PAGE电泳法对其进行了鉴定。检测了Mn取代Hb的过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性。结果表明,Mn取代Hb的过氧化物酶活性是Hb的70%,过氧化氢酶活性是Hb的1.9倍。 Hb的催化活性与其蛋白质结构也密切相关,研究了Hb的荧光特性与其过氧化物酶活性之间的关系。比较了不同温度、乙醇和NaCl浓度对Hb催化活性、稳定性和荧光特性的影响,比较了Hb在四聚体状态和解离后的二聚体状态的催化活性的变化。当荧光发射峰红移,其催化活力迅速下降,Hb疏水性较高时,

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 绪论

1 辣根过氧化物酶(HPR)及其模拟酶

1.1 HRP的催化反应机理及其模拟酶

1.2 HRP模拟酶的分类

1.3 HRP模拟酶研究现状

1.4 HRP模拟酶在分析工作中的应用

1.5 展望

2 Hb的结构与抗氧化特性

2.1 Hb的构造

2.2 Hb的抗氧化特性

3 Hb的修饰及其电化学活性

3.1 修饰的Hb作为血液替代品

3.2 血红素蛋白质的电子传递及电催化特性

4 酶反应中间体和反应机理

4.1 活性氧中间体

4.2 酶反应活性中间体

4.3 过氧化物酶的反应中间体

5 过氧亚硝基阴离子

5.1 生物系统中ONOO~-的产生

5.2 ONOO~-的结构与性质

5.3 ONOO~-与生物物质的作用及生物系统内的影响因素

5.4 ONOO~-在生物系统中的意义

5.5 ONOO~-的清除

5.6 展望

第二章 血红蛋白催化邻苯二胺氧化反应机理

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.2 产物的制备

1.3 中间体的制备

1.4 快速停流分光光度法测定Hb与H2O2反应的中间体

2 结果

2.1 紫外-可见吸收光谱

2.2 温度对中间体稳定性的影响

2.3 产物、中间体及相关物质的红外光谱

2.4 OPDA、产物及中间体的质谱

3 讨论

3.1 中间体及产物的结构

3.2 MetHb的催化反应机理

第三章 血红蛋白结构与其催化活性之间的关系

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

1.2 Mn-Hb制备

1.3 非变性SDS-PAGE检测Mn-Hb-

1.4 H_2O_2浓度测定

1.5 POD活性检测

1.6 CAT活性检测

1.7 反应体系的荧光光谱

2 结果与分析

2.1 Mn-血红素的吸收光谱

2.2 Mn-Hb的SDS-PAGE鉴定

2.3 pH对Mn-Hb催化活性的影响

2.4 Mn-Hb的POD活性

2.5 Mn-Hb的CAT活性

2.6 Hb的内部荧光性质

2.7 不同温度下Hb的荧光光谱和酶学性质

2.8 不同乙醇浓度对Hb酶学性质和荧光光谱的影响

2.9 NaCl浓度对Hb稳定性和荧光光谱的影响

2.10 高铁Hb的荧光光谱和催化活性

3 讨论

第四章 血红蛋白作为标记试剂在酶联免疫分析中的应用

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.2 溶液的配制

1.3 Hb-IgG的制备

1.4 Hb及Hb-IgG活力的测定

1.5 免疫分析

2 结果与讨论

2.1 Hb-IgG的制备结果

2.2 Hb-IgG催化反应条件的优化

2.3 Hb-IgG的催化活性

2.4 测定人IgG的标准工作曲线及样品分析

第五章 血红蛋白／聚邻苯二胺膜电极的制各及其电催化性能的研究

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.2 POPDA及POPDA／Hb膜电极的制备

1.3 红外光谱的测定

1.4 Hb活性的测定方法

2 结果

2.1 邻苯二胺的电聚合特性

2.2 聚合物的红外光谱

2.3 Hb在POPDA膜中固定化及其电极特性

2.4 POPDA膜中固定化Hb的氧化还原特性

3 讨论

第六章 过氧亚硝基阴离子对氧合血红蛋白的氧化损伤

1 材料与方法

1.1 ONOO~-的制备

1.2 oxyHb的制备

1.3 ONOO~-与oxyHb的反应

1.4 ONOO~-对正丁醇抽提液中血红素浓度的影响

2 结果

2.1 ONOO~-浓度的影响

2.2 温浴时间的影响

2.3 CO_2的影响

2.4 pH的影响

2.5 温度的影响

2.6 ONOO~-对oxyHb正丁醇抽提液中血红素浓度的影响

3 讨论

第七章 过氧亚硝基阴离子及亚硝酸盐对血红蛋白催化反应的干扰

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.2 实验步骤

2 结果

2.1 ONOO~-和NO_2~-对OPDA的氧化

2.2 CO_2对ONOO~-氧化OPDA的影响

2.3 ONOO~-对愈创木酚的氧化作用

2.4 NO_2~-对PR的氧化的影响

2.5 NO_2~-与H_2O_2和Hb的反应

2.6 愈创木酚和NO_2~-与ferrylHb的反应

3 讨论

研究总结

研究展望

参考文献

博士生在读期间发表和待发表论著目录

致谢

发布时间: 2006-03-27

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