食品中金霉素残留的胶体金免疫检测方法研究

论文摘要

本文研究胶体金免疫层析法（试纸条）与斑点金免疫渗滤法快速检测食品中金霉素残留。采用戊二醛交联法和混合酸酐法制备了金霉素-BSA免疫抗原,戊二醛交联法制备了金霉素-明胶免疫抗原。分别将三种不同的免疫抗原按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,酶联免疫吸附法鉴定出多抗中含有抗金霉素的特异性抗体,金霉素-BSA免疫抗原产生的ELISA效价最高达320 000。亲和力实验证明戊二醛法制备的免疫抗原产生的抗体对金霉素的亲和性要高于混合酸酐法制备的免疫抗原产生的抗体对金霉素的亲和性。在胶体金免疫层析法中,将羊抗兔抗体和金霉素-明胶包被抗原包被在硝酸纤维素膜上,分别作为质控线和检测线,组装试纸条。包被在硝酸纤维素膜上的金霉素-明胶固相抗原与被测溶液中游离金霉素竞争结合胶体金标记的抗金霉素多克隆抗体,通过可见的线条颜色深浅判断结果。在斑点金免疫渗滤实验中,将制备的金霉素多克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上,用以竞争捕获胶体金标记的金霉素-BSA包被抗原和样品中游离金霉素,通过可见的斑点颜色深浅判断结果。实验结果表明试纸条法的检测限为0.7μg/mL,在金霉素浓度为0.6～1.0μg/mL范围内可实现定量分析。在四环素浓度大于1.0μg/mL时,与金霉素存在交叉反应性,其结果与高效液相测定结果一致。斑点渗滤方法的检测限为0.4μg/mL,在金霉素浓度为0.6～1.0μg/mL范围内可实现定量分析,其结果与酶联免疫方法的测定结果一致。试纸条法与斑点渗滤法均可应用于食品中金霉素残留的快速检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 金霉素残留检测研究进展
• 1.1.1 金霉素及其应用
• 1.1.2 金霉素药物的残留与危害
• 1.1.3 金霉素药物残留的检测方法
• 1.2 胶体金免疫技术及其应用
• 1.2.1 胶体金免疫层析技术
• 1.2.2 胶体金免疫渗滤技术
• 1.2.3 胶体金免疫技术发展方向
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第2章 金霉素多克隆抗体的制备及鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.2 金霉素多克隆抗体的制备
• 2.2.1 金霉素免疫抗原和包被抗原的制备
• 2.2.2 免疫程序
• 2.2.3 血清纯化
• 2.3 ELISA 条件优化及金霉素特异性抗体效价测定
• 2.4 金霉素特异性抗体亲和力的测定
• 2.4.1 金霉素多克隆抗体最佳稀释度的选择
• 2.4.2 间接竞争ELISA 测定特异性抗体的亲和力
• 2.5 结果与分析
• 2.5.1 金霉素-BSA、金霉素-明胶免疫抗原的合成
• 2.5.2 金霉素包被抗原的合成
• 2.5.3 琼脂双扩检测抗体效价
• 2.5.4 金霉素特异性抗体的ELISA 效价测定
• 2.5.5 金霉素特异性抗体亲和力的测定
• 2.6 讨论
• 2.6.1 金霉素多克隆抗体的制备
• 2.6.2 金霉素多克隆抗体的鉴定
• 2.7 小结
• 第3章 试纸条的研制及检测
• 3.1 实验材料
• 3.2 胶体金的制备及其鉴定
• 3.2.1 玻璃器皿的准备
• 3.2.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金
• 3.2.3 胶体金的质量鉴定
• 3.3 金标抗体的制备及质量鉴定
• 3.3.1 抗体标记用胶体金颗粒的大小选择
• 3.3.2 抗体标记pH 的选择
• 3.3.3 稳定胶体金最适抗体蛋白用量的选择
• 3.4 试纸条的组装
• 3.4.1 硝酸纤维素膜的选择
• 3.4.2 硝酸纤维素膜上包被抗原浓度的选择
• 3.4.3 包被时间及温度的选择
• 3.4.4 封闭液的选择
• 3.4.5 封闭时间及温度的选择
• 3.4.6 玻璃纤维上金标抗体喷涂量的选择
• 3.4.7 组装试纸条
• 3.5 试纸条的测试
• 3.6 试纸条稳定性及重复性试验
• 3.7 试纸条交叉反应试验
• 3.8 试纸条与高效液相法的比较
• 3.9 结果与分析
• 3.9.1 柠檬酸三钠还原法制备的胶体金质量鉴定
• 3.9.2 抗体标记用胶体金颗粒大小选择
• 3.9.3 抗体标记pH 的选择
• 3.9.4 稳定胶体金最适抗体蛋白用量的选择
• 3.9.5 硝酸纤维素膜的选择
• 3.9.6 硝酸纤维素膜上包被抗原浓度的选择
• 3.9.7 包被时间及温度的选择
• 3.9.8 封闭液的选择
• 3.9.9 封闭时间及温度的选择
• 3.9.10 玻璃纤维上金标抗体喷涂量的选择
• 3.10 试纸条测试
• 3.10.1 加标回收率
• 3.10.2 试纸条在标准液中的测试
• 3.11 试纸条稳定性及重复性试验
• 3.12 试纸条交叉反应试验
• 3.13 试纸条与高效液相色谱法测定的比较
• 3.14 讨论
• 3.14.1 胶体金颗粒的制备
• 3.14.2 金标抗体的制备
• 3.14.3 试纸条材料的选择和处理
• 3.14.4 玻璃纤维纸上金标记物的喷涂
• 3.14.5 批间产品的稳定性
• 3.15 小结
• 第4章 斑点渗滤试剂盒的研制及检测
• 4.1 实验材料
• 4.2 金标抗原的制备及质量鉴定
• 4.2.1 标记抗原用胶体金颗粒大小选择
• 4.2.2 抗原标记pH 的选择
• 4.2.3 稳定胶体金最适抗原蛋白用量的选择
• 4.3 斑点渗滤实验
• 4.3.1 硝酸纤维素膜的选择
• 4.3.2 硝酸纤维素膜上包被抗体浓度的选择
• 4.3.3 封闭条件的选择
• 4.3.4 金标抗原用量的选择
• 4.3.5 斑点渗滤检测
• 4.4 斑点渗滤试剂盒稳定性、重复性及交叉反应试验
• 4.5 斑点渗滤试验与 ELISA 测定比较
• 4.6 结果与分析
• 4.6.1 标记金霉素-BSA 包被抗原用胶体金颗粒大小选择
• 4.6.2 金霉素-BSA 包被抗原标记pH 的选择
• 4.6.3 稳定胶体金最适抗原蛋白用量的选择
• 4.7 斑点渗滤实验
• 4.7.1 硝酸纤维素膜的选择
• 4.7.2 金标抗原用量的选择
• 4.8 胶体金渗滤实验与分析
• 4.9 胶体金渗滤实验稳定性和交叉性测试
• 4.10 胶体金渗滤实验与酶联免疫测定比较
• 4.11 讨论
• 4.12 小结
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间研究成果