论文摘要
涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma,SACC）发病率居涎腺恶性肿瘤的第二位,是口腔颌面部最具侵袭性的恶性肿瘤之一。该肿瘤生长缓慢,但浸润性生长,常侵犯周围神经血管,易局部复发,并早期发生肺转移。目前其治疗以手术切除为主,由于肿瘤的侵袭性生长方式,很难一次性完整摘除,同时该肿瘤对放疗、化疗均不敏感,所以预后很差,对于复发及转移的病例治疗比较棘手,寻找有效的治疗方法一直是口腔医学工作者关注的焦点。随着涎腺腺样囊性癌相关基因及分子生物学研究的发展,腺样囊性癌基因治疗的相关研究也在不断深入。RNA干扰（RNA interference, RNAi）现象发现于1995年,1998年引起人们的关注。RNAi是由双链RNA介导的、在转录后水平沉默相应基因表达的新基因阻断技术,近几年已成为基因治疗研究的热点。其原理是利用小片段RNA（siRNA）碱基互补的原理,特异性地结合癌基因的mRNA,干扰其转录和翻译,阻抑癌蛋白的合成,使癌细胞向成熟方向分化或诱导细胞凋亡,从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。原癌基因c-Myc是myc基因家族的重要成员,其产物属核蛋白类的磷酸化蛋白质,在正常细胞的增殖分化过程中起重要作用。大量研究表明c-Myc基因过度表达与多种头颈部肿瘤的发生密切相关,且在肿瘤血管生成过程中起重要作用。ras基因是一种促癌生长基因,在细胞内信号传递和细胞增殖过程中起关键和核心作用。ras基因产物p21蛋白是细胞信号传递的枢纽,它的激活可导致细胞无限制增殖和永生化,致使肿瘤发生。ras基因包括H-ras、K-ras和N-ras。有研究发现,H-ras基因mRNA在正常腮腺组织内处于不表达或微弱表达状态,而SACC组织中H-ras呈高水平异常表达,且与SACC的恶性程度、浸润性和转移性等密切相关。抑制H-ras基因的表达将为探讨SACC的组织发生、恶性程度以及对肿瘤的治疗提供新的途径。涎腺腺样囊性癌和其它肿瘤一样,是一种多基因性、多步骤、多阶段的发生过程,发病机制复杂,治疗困难。是否可以利用RNAi技术沉默腺样囊性癌细胞中活跃的癌基因c-Myc和/或H-ras的表达,以达到阻止或减缓肿瘤细胞生长的目的尚属未知领域。在c-Myc癌基因受到干扰之后,其它癌基因的表达是否受到影响,这是值得探讨的课题。c-Myc及H-ras基因的联合沉默对肿瘤的治疗效果也具有重要的探索价值。目前,国内外文献尚未见RNA干扰技术在腺样囊性癌方面应用的相关报道。本实验构建了c-Myc基因及H-ras基因靶向的pc-Myc-shRNA及pH-ras-shRNA真核重组RNA干扰质粒,采用脂质体包裹技术将质粒转染腺样囊性癌ACC-M细胞,通过沉默c-Myc和H-ras基因的表达,采用多种方法观察其对ACC-M体内外细胞增殖及凋亡的影响。为观察RNAi技术对体内腺样囊性癌的治疗效果,本实验建立了腺样囊性癌ACC-M细胞裸鼠移植瘤模型,用RNAi质粒进行裸鼠移植瘤瘤内注射治疗,观察其对肿瘤生长的抑制作用,为将来的肿瘤临床治疗提供可靠的实验数据。本实验共分为三个部分:第一部分c-Myc及H-ras靶向shRNA质粒的构建及其对腺样囊性癌细胞目的基因沉默效应的研究目的:构建c-Myc及H-ras基因靶向shRNA质粒,通过目的基因干扰效果检测,进行最佳靶向位点的筛选鉴定。方法:设计合成以c-Myc及H-ras基因为靶向目标的shRNA,将其定向克隆到真核表达载体pGenesil-1中形成重组质粒;利用脂质体介导的方法将质粒转染至人腺样囊性癌肺高转移细胞株（ACC-M）,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、免疫荧光蛋白定量分析等方法对目的基因mRNA及蛋白水平的表达变化进行检测,分析shRNA干扰质粒对腺样囊性癌细胞目的基因的沉默效应,进行最佳靶向位点的筛选。结果:c-Myc基因靶向的pc-Myc1、pc-Myc2、pc-Myc3及H-ras基因靶向的pH-ras1、pH-ras2、pH-ras3以及阴性对照pHK真核重组质粒均符合设计要求;细胞质粒转染后,除pH-ras2转染后细胞大量悬浮死亡外,pc-Myc1、pc-Myc2、pc-Myc3、pH-ras1、pH-ras3及pHK各组细胞转染效率分别为62.86%、64.57%、61.18%、60.49%、63.56%及58.03%,各组间转染效率无显著性差异（P>0.05）。瞬时转染pc-Myc1、pc-Myc2、pc-Myc3及pHK质粒对c-Myc mRNA水平表达抑制率分别为41.18%、60.00%、68.24%及0.00%,其中pc-Myc3质粒的抑制效率最高;瞬时转染pH-ras1、pH-ras3及pHK质粒对H-ras mRNA水平表达抑制率分别为85.24%、75.41%及6.56%,其中pH-ras1质粒的抑制效率最高。瞬时转染pc-Myc1、pc-Myc2、pc-Myc3及pHK质粒对c-Myc蛋白表达抑制率分别为48.3%、42.61%、57.95%及0.00%,流式细胞术检测结果与免疫细胞化学染色结果相一致;瞬时转染pH-ras1、pH-ras3及pHK质粒对H-ras蛋白水平表达抑制率分别为55.21%、42.92%及2.45%,与流式细胞术检测H-ras蛋白表达变化结果相一致。结论:成功构建了靶向c-Myc及H-ras癌基因的shRNA干扰质粒; shRNA质粒可成功转染ACC-M细胞,各组质粒转染效率达60%,各组间无显著性差异;shRNA质粒介导的RNA干扰效应与靶位点高度相关,具有序列特异性,pHK质粒对H-ras及c-Myc基因无沉默效应; c-Myc基因为靶向构建的pc-Myc三组质粒均可下调ACC-M细胞中c-Myc基因的表达,其中pc-Myc3质粒的沉默效应最强;H-ras基因为靶向构建的pH-ras三组质粒中,pH-ras1质粒对ACC-M细胞中H-ras基因的沉默效应最强。第二部分c-Myc基因沉默对腺样囊性癌细胞增殖及VEGF表达影响的研究目的:建立稳定表达pc-Myc质粒的ACC-M细胞株,通过不同作用途径探讨c-Myc基因为靶向的pc-Myc质粒在体外体内多阶段对腺样囊性癌细胞增殖、细胞周期的影响以及对VEGF表达的调控。方法:通过G418筛选、绿色荧光蛋白监测及目的基因mRNA水平表达检测鉴定,建立稳定表达pc-Myc及pHK质粒的细胞株;流式细胞术测定pc-Myc质粒对肿瘤细胞生长周期的影响;MTT法检测各组肿瘤细胞的增殖活性;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成率;裸鼠皮下移植瘤实验检测pc-Myc在体内对ACC-M细胞增殖活性的影响,免疫组织化学SP法检测移植瘤组织c-Myc、VEGF蛋白水平的表达变化及CD34染色检测微血管密度。结果:成功建立稳定表达质粒的细胞株;pc-Myc质粒能有效降低ACC-M细胞中c-Myc基因表达,抑制率为79.41%;流式细胞术结果示实验组细胞G0/G1期比例明显增加至73.40%,显著高于阴性对照组的33.30%及空白对照组的38.80% ; MTT及平板克隆实验结果示ACC-pc-Myc细胞增殖活性明显受抑;c-Myc沉默细胞的裸鼠体内成瘤能力降低,pc-Myc质粒转染组成瘤率及肿瘤体积显著低于对照组;实验组移植瘤内c-Myc蛋白表达量明显减少的同时,VEGF的表达及微血管密度也降低。结论:建立了稳定表达pc-Myc干扰质粒的细胞系;pc-Myc干扰质粒可抑制ACC-M体外增殖活性,将更多细胞阻滞于G0/G1期;建立了腺样囊性癌ACC-M细胞裸鼠皮下移植瘤模型;pc-Myc质粒能有效抑制ACC-M细胞在裸鼠体内的增殖活性;pc-Myc干扰质粒明显降低裸鼠肿瘤组织内c-Myc蛋白表达的同时,能有效降低VEGF的表达及组织内微血管密度。第三部分H-ras基因沉默对腺样囊性癌细胞增殖活性及细胞凋亡影响的研究目的:在获得H-ras干扰效果最佳的肿瘤细胞克隆基础上,进一步研究H-ras沉默对ACC-M肿瘤细胞体内外增殖活性、细胞凋亡等生物学行为的影响以及H-ras基因沉默作用的持久性、有效性。方法:通过G418筛选、绿色荧光蛋白监测及目的基因mRNA水平表达检测鉴定,建立稳定表达pH-ras质粒的细胞株;绘制细胞生长曲线,平板克隆形成实验检测各组细胞克隆形成率;TUNEL及流式细胞术进行各组细胞凋亡分析;裸鼠皮下移植瘤实验检测H-ras沉默对细胞体内增殖的影响;移植瘤原代培养观察荧光表达及细胞生物学特征;免疫组织化学法检测H-ras蛋白的表达变化;流式细胞术及石蜡切片TUNEL测定移植瘤组织细胞凋亡率。结果:成功建立了稳定表达质粒的细胞株;pH-ras质粒能有效降低ACC-M细胞中H-ras基因表达,抑制率为76.39%;平板克隆结果示ACC-pH-ras细胞增殖活性明显受抑;流式细胞术结果示实验组细胞凋亡率为30.82%,显著高于阴性对照组及空白对照组的4.29%和4.16%;H-ras沉默细胞的裸鼠体内成瘤能力降低,pH-ras质粒转染组成瘤率及肿瘤体积显著低于对照组;原代培养可见大量瘤细胞表达绿色荧光;实验组瘤内H-ras蛋白表达量明显减少;实验组肿瘤细胞凋亡率为41.55%±4.25%明显高于对照组的4.73%±1.35 %（P<0.05）。结论:建立了稳定表达pH-ras干扰质粒的细胞株; pH-ras干扰质粒可持续有效抑制ACC-M细胞体外增殖活性,诱导更多肿瘤细胞凋亡;pH-ras质粒能有效抑制ACC-M细胞在裸鼠体内的增殖活性;pH-ras质粒沉默H-ras基因可抑制ACC-M细胞裸鼠皮下移植瘤的增殖,并有效诱导肿瘤细胞凋亡。
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