家蚕核rDNA的克隆及其分子系统发育分析

论文摘要

本研究以家蚕为材料,使用 SES、SDS、KI、CTAB 法提取家蚕的基因组 DNA,紫外和琼脂糖凝胶电泳表明:SES 法提取家蚕丝腺 DNA 简便、快捷,提取的 DNA质量较高。以其他昆虫的 rDNA 的保守序列为参考设计了多对特异引物,分段克隆并测序家蚕 rDNA 的全序列和柞蚕 18S rDNA。测序结果拼接后表明家蚕 18S rDNA 为1907 bp、ITS1 为 762 bp、5.8S 为 167 bp、ITS2 为 878 bp、28S rDNA 则长达 3981 bp,家蚕 rDNA 总长度为 7695 bp。将家蚕 18S rDNA、柞蚕 18S rDNA 与从 GenBank 中检索出的 14 个目 18 种昆虫的 18S rDNA 用 Clustal1.83 软件进行多序列比对,表明昆虫的 18S rDNA 有四段相对保守序列,在同源区各物种昆虫之间碱基差别不是很大,变异主要由转换和巅换引起,而在多变区则主要由插入、缺失引起。用系统发育软件PHYLIP 3.63 最大简约法和距离法以 18S rDNA 全序列及不同的同源区构建系统发育树,表明各种昆虫在分子系统发育树中的位置虽略有变化,但其关系基本一致:鳞翅目昆虫和双翅目昆虫首先在内部聚类后再相聚,两目昆虫之间的亲缘关系较近;等翅目与蜚蠊目关系较为接近;弹尾目、缨尾目关系较接近,与其他昆虫的亲缘关系较远;膜翅目分类地位多变说明膜翅目的 18S rDNA 进化较快;通过对这些系统发育树的比较,为形态分类学存在争论的将半翅目和同翅目并为一系、捻翅目自成一系提供了分子水平的证据。用 18S rDNA 不同的同源区所构建的系统发育树大致相同,表明 18SrDNA 的不同同源区在进化上有协同进化的现象,且在 5’端和 3’端则在进化上更为保守,同时结果表明 18S rDNA 是研究中等阶元以上的分子系统发育的有效标记分子。 在 ITS1 序列内部存在明显的 G、T 结构:其中 A 占 25.40%,T 为 30.30%;C为19.93%,G为24.37%,在进化过程中有碱基选择的偏好性;而ITS2 的A 占28.35%,T 为 31.50%;C 为 18.11%,G 为 22.05%, A、T 碱基明显较多。通过用 Clustal 1.83的自举 NJ 法构建的系统发育树表明,ITS1 比 ITS2 在进化上相对保守,ITS2 在进化过程中变异较大,ITS1 适合于中等阶元的系统发育研究,而 ITS2 则可用于近缘种内的系统发育研究;28S rDNA 最长,碱基组成基本均衡,没有偏异现象。通过对家蚕rDNA 的克隆与序列分析,表明家蚕 rDNA 不同区段进化速率明显不同,为 rDNA 在家蚕起源与进化、品种选育与鉴定等方面的研究提供了一定的基础。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1. 系统发育学研究简介
• 2. 昆虫分子系统发育的研究技术
• 2.1 蛋白质的分子系统学方法
• 2.2 DNA 分子标记
• 3. 用于昆虫分子系统学研究的标记分子
• 4. 系统发生树的构建方法
• 5. 昆虫分子系统发育研究概况
• 6. 家蚕的分子系统学研究进展
• 7. 本研究的意义
• 第二章 家蚕、柞蚕18S rDNA 的克隆及分子系统发育分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 DNA 提取的材料
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 溶液的配制
• 1.4 家蚕基因组提取方法
• 1.5 DNA 检测
• 1.6 18S rDNA 特异引物的设计
• 1.7 18S rDNA 目的片段的扩增
• 1.8 DNA 序列分析
• 1.9 相关18S rDNA 基因的获得与比对
• 1.10 数据分析与分子系统发育树的构建与检验
• 2 结果与分析
• 2.1 基因组的提取方法
• 2.2 PCR 的产物的电泳检测
• 2.3 家蚕、柞蚕18S rDNA 的序列分析
• 2.4 与其它昆虫18S rDNA的同源区和多变区的比较
• 2.5 系统发育关系分析
• 3. 讨论
• 3.1 18S rDNA序列
• 3.2 建树方法的比较
• 3.3 18S rDNA序列在昆虫纲系统发育中的应用
• 第三章 家蚕核rDNA 基因ITS 和28S rDNA 的克隆与序列分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 ITS、28S rDNA 目的片段特异引物的设计
• 1.4 PCR 产物的序列测定
• 1.5 其他ITS1和ITS2序列来源
• 1.6 序列分析与分子系统树的构建
• 2. 结果与分析
• 2.1 PCR 的产物的电泳检测
• 2.2 家蚕ITS、5.8S、28S rDNA 的序列分析
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介