模拟失重对大鼠承重骨组织细胞凋亡的影响

论文摘要

研究背景地球上,正常人体的运动系统承受两种刺激：重力（被动刺激）和运动（主动刺激）。两者相结合、相互作用通过一系列生理、生化过程维持骨组织的结构来适应这种力学环境。空间飞行中的最重要环境特征之一就是微重力（失重）。失重是物体只表现为质量而不表现为重量的特殊力学环境-微重力（10-6-10-9g）环境,是航空航天过程中人类必须面临和克服的问题,已有的研究表明,失重可导致心血管系统、骨骼系统、免疫系统等的生理甚至病理改变。研究认为,上述生理变化的产生是失重通过感觉传入信息变化、体液头向转移和重力负荷力学作用消失三个不同层次的生理效应发生作用。骨质疏松是一种常见的代谢性骨病,以单位体积内骨量减少,骨矿物质沉积减少,而骨的成分含量不变为特点。骨质疏松分为原发性骨质疏松与继发性骨质疏松。失重性骨质疏松属于继发性骨质疏松的一种,是以力学因素为主所致的骨质疏松。失重导致骨骼系统病理生理改变的相关研究表明,长期载人航天飞行中,航天员长时间生活在太空中,会因失重导致航天员出现废用性骨质疏松。失重导致的废用性骨质疏松主要表现为骨量丢失、骨矿盐含量下降、骨密度降低、骨生物力学性能下降,粪钙和尿钙排出量增加,血钙升高,出现负钙平衡。在失重环境,人体所发生的一系列适应性改变中,大部分系统的变化具有一定自限性,在航天飞行中会达到新的平衡状态,不再继续发展,只有骨骼系统的变化呈现出进行性的过程,因此,长期的失重环境,骨矿盐的持续丢失是航天飞行中人类所面临的严重生理反应之一,也是妨碍人类长期太空停留和探索外星球的主要障碍之一。航天医学界非常重视失重条件下骨代谢的研究,虽然进行了大量的研究工作,但骨丢失的机理仍未阐明,虽已采取了各种防护措施,仍不能有效地防止失重环境下负重骨的骨丢失。由于国际空间站的建立、火星探测计划的实施,人类在太空中停留的时间将进一步延长,如没有有效的防护措施,骨的持续大量丢失,有可能导致高钙血症、肾结石、软组织钙化、病理性骨折等病理变化。因此,预防失重状态下骨丢失的研究已成为国内外航天医学领域的重点和热点。人体的骨组织由骨祖细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等构成。成骨细胞、骨细胞是骨组织中最重要的力学感受细胞,目前大量研究已证实,失重和模拟失重导致的骨丢失是一个以骨形成抑制起主导作用,并以成骨细胞数量减少、骨矿形成障碍和骨成熟延迟为特征的病理生理过程。由于微重力下成骨细胞、骨细胞等缺乏必要的机械力刺激,使其增殖和分化功能下降,导致成熟成骨细胞、骨细胞数量减少,骨形成下降,这是造成空间骨丢失的主要原因。目前关于失重性骨丢失的研究焦点和热点主要是成骨细胞、骨细胞对微重力的响应、信号传导、基因表达和功能变化等。研究目的：建立大鼠尾部悬吊模拟失重模型,研究模拟失重对骨组织中细胞凋亡的影响,并从Fas/FasL途径上探讨失重引起骨组织中细胞凋亡的机制。研究方法：1、模型制备：5周龄雄性SD大鼠36只随机分为（7d、14d及21d）尾吊模拟失重组和相应对照组;尾吊模拟失重组大鼠用透气胶带粘贴于尾部近2/3部两侧,透气胶布远端悬挂于自由滑动的塑料环,使大鼠呈头低位,身体与地面呈30°,后肢自由悬空不负重；对照不予处理,于相同笼具等量饮食饲养。2、对各模型组大鼠反应的观察：观察尾吊期间大鼠活动、饮食、体重变化、皮毛尾部色泽；建模后7d、14d及21d取血清行骨代谢生化指标测量,取右侧胫骨近端制备石蜡切片。3、骨代谢生化指标测量：利用美国杜邦（Dimension AR）全自动生化分析仪分别测血清钙（偶氮胂Ⅲ法）、磷（磷钼酸比色法）、碱性磷酸酶（硝基苯磷酸二钠比色法）。根据抗原与抗体竞争性结合的原理,严格按使用说明操作,用放免法在SN-697型放射免疫分析仪上测骨钙素。4、骨组织原位细胞凋亡检测：取右侧胫骨近端制备石蜡切片,原位细胞凋亡检测技术检测骨组织中细胞凋亡。TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labeling）技术原理是生物素标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞或凋亡小体中由核酸内切酶切断的DNA短链的3’末端缺口,并与连接过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的链霉亲和素特异性结合,后者可催化底物显色,特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞。5、骨组织Fas蛋白含量测定：取右侧胫骨近端制备石蜡切片,免疫组织化学方法检测骨组织中Fas蛋白含量。免疫组化是应用免疫学基本原理-抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（酶、金属离子、荧光素、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）,对其进行定位、定性及定量的研究。统计方法：所有数据采用x±s表示,用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,组间两独立样本t检验、单向方差分析、重复测量方差分析及双因素方差分析（析因分析）进行统计分析,LSD.SNK多重检验,当方差不齐时选用Dunnett’s T3、Dunnett’sC多重检验,P<0.055为差异具有显著性意义。研究结果：1、大鼠尾吊情况：尾吊期间大鼠活动、进食无受限,无反转咬尾、尾部缺血坏死及感染现象,动物成活,悬吊3d后两组大鼠体质量基本保持稳定增长（P>0.05）；2、骨代谢生化指标测量：7d、14d、21d尾吊模拟失重组大鼠血清中ALP、BGP含量均显著低于相应对照组,有统计学差异（7d,14d及21d ALP:P=0.000,0.000,0.003<0.01：BGP:P=0.026,0.010,0.040<0.05）;但血Ca、P浓度均较相应对照组升高,7d模型组显著升高,有统计学差异（Ca：P=0.004,0.000<0.01；Pi：P=0.000,0.001<0.01）,14d及21d尾吊模拟失重组与相应对照组无统计学差异（Ca：P=0.162>0.05；Pi：P=0.067>0.05）；3、骨组织原位细胞凋亡检测：正常对照组大鼠胫骨干骺端小梁骨区域（成骨区）骨小梁排列规整、阳性染色（深棕色）细胞核数量少,而尾吊模拟失重组大鼠胫骨干骺端小梁骨区域（成骨区）骨小梁变细、数量减少、排列紊乱、小梁间隙增宽,可见大量成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞核呈阳性染色（深棕色）。各模型组骨组织中成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞凋亡指数明显高于相应对照组,有统计学差异（7d,14d,21d P=0.000,0.000,0.000<0.01）,随着尾吊时间延长,14d、21d模拟失重组骨组织中细胞凋亡指数比7d模拟失重组有所下降,差异有统计学意义（与7d比,14d,21d P=0.000,0.000<0.01）,而21d模拟失重组较14d模拟失重组骨组织中细胞凋亡指数有所下降,差异有统计学意义（21d与14d比：P=0.000<0.01）。4、骨组织Fas蛋白含量测定：大鼠骨组织Fas染色阳性细胞范围广泛,包括成骨细胞、骨细胞以及骨髓间充质细胞,正常对照组大鼠胫骨干骺端小梁骨区域（成骨区）骨小梁排列规整,仅有少量成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞胞膜或胞浆呈阳性染色。尾吊模拟失重组胫骨干骺端小梁骨区域（成骨区）骨小梁变细,数量减少,排列紊乱,小梁间隙增宽,可见大量成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞胞膜或胞浆呈阳性染色,且染色深。各模型组骨组织中Fas蛋白含量均高于相应对照组,有统计学差异（7d,14d,21d P=0.000,0.000,0.000<0.01）,且随着尾吊时间延长,模拟失重组中Fas蛋白表达有所减少,各组间有统计学差异（与7d组比,14d,21d P=0.001,0.000<0.01；21d与14d比,P=0.000<0.01）。研究结论：1、本实验所建立尾吊模拟失重环境大鼠模型,成功模拟了体液头向转移和负重骨脱负荷两个失重对机体作用的主要生理效应,大鼠应激反应小,为地面模拟失重环境的研究提供了较好的动物模型；2、模拟失重环境影响骨代谢生化指标。血钙升高,出现负钙平衡。3、模拟失重环境大鼠骨组织中Fas蛋白的表达增加。4、模拟失重环境诱导骨组织中成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质干细胞的细胞凋亡。5、Fas蛋白的表达与成骨细胞、骨细胞凋亡率密切相关,由此推断,模拟失重环境促进了Fas蛋白的表达,从而诱导了骨细胞、成骨细胞的凋亡。6、随着尾吊模拟失重时间延长,骨组织中Fas蛋白表达及细胞凋亡率有下降趋势,说明模拟失重的早期对骨组织细胞凋亡的影响最为显著,从而推断失重性骨质疏松应着重于早期防治。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 大鼠模拟失重环境实验模型的制备
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 分析和讨论
• 4 结论
• 第二章 模拟失重环境对大鼠骨组织细胞凋亡的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 分析与讨论
• 4 结论
• 第三章 模拟失重环境对大鼠骨组织Fas蛋白表达的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 分析与讨论
• 4 结论
• 全文小结
• 参考文献
• 中英文缩略词表
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表论文
• 致谢
• 统计学证明