论文摘要
哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病。近40年来，哮喘的发病率和死亡率在世界各地持续增长。研究一般认为，哮喘主要是一种炎症疾病。目前，关于哮喘的免疫基础已经有比较多的研究，对于参与哮喘过程中的炎症因子也有比较清楚的了解，但对于哮喘的内源性保护机制的研究却一直为人们所忽视。最近，Que et al研究发现，当小鼠敲除一种称为亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNO reductase，GSNOR）的基因后，小鼠致敏后表现出正常的气道炎症反应，但在气道高反应性中受到保护，同时GSNOR的底物亚硝基硫醇（S-nitrosothiol，SNO）充盈；而野生型小鼠致敏后GSNOR活力上调，SNO过度降解，小鼠表现出气道高反应性。该研究提示SNO对气道可能有保护作用，而在哮喘气道中，由于SNO降解酶GSNOR活力异常升高，导致SNO代谢异常，从而失去了气道保护作用。GSNOR作为SNO的调节酶，可能在哮喘病发生中起关键作用，GSNOR也可能成为哮喘治疗中新的靶标。但GSNOR在气道中的分子调控机制还不清楚。近年来，关于室内空气甲醛污染与人体健康效应的研究日益广泛深入。甲醛暴露被认为与哮喘的危险度有关，动物学研究也表明，甲醛暴露可改变气道平滑肌张力，但其机制还不清楚。由于GSNOR蛋白在调节气道张力中起关键作用，我们提出假说，认为甲醛暴露可能可以上调气道GSNOR活力，这可能是室内空气污染物甲醛诱导哮喘发生的重要机制之一。同时，由于甲醛暴露可导致机体氧化胁迫的上升，而哮喘病发生与氧化胁迫的上升紧密相关，我们进一步提出，甲醛诱导气道GSNOR酶活力的上升可能与氧化胁迫上升有关。本课题就甲醛对气道GSNOR的诱导作用及其与氧化胁迫的关系进行了体内和体外实验，以验证我们的假说，实验结果如下：1．气态甲醛对小鼠气道GSNOR的诱导作用为证实气态甲醛对小鼠气道GSNOR的诱导作用，我们将昆明雄性小鼠随机分为3组（n=6），采用舱发生气体染毒技术对小鼠进行72h连续动态染毒，并使用RT-PCR和酶学方法检测的方法检测暴露后小鼠肺匀浆中GSNOR的表达和酶活力。RT-PCR结果表明，甲醛暴露可显著诱导小鼠气道GSNOR-mRNA转录水平的上升（p＜0.05），而酶活力检测结果表明，气态甲醛导致小鼠气道GSNOR酶活力极显著上升（p＜0.01），并呈明显的剂量-效应关系，这些结果表明，气态甲醛暴露对小鼠气道GSNOR有诱导作用，这可能是甲醛诱导哮喘发生的重要机制之一。2．气态甲醛通过GSH途径对GSNOR的上调作用近年来的研究表明，哮喘是一种和氧化胁迫上升有关的疾病，哮喘病人气道氧化胁迫显著上升，还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）显著下调。甲醛暴露可导致机体氧化胁迫的上升，为进一步证实气态甲醛对GSNOR的上调作用是否是通过GSH途径，雄性昆明小鼠随机分为3组，其中3.0+LA组在接受3.0 mg／m3甲醛暴露同时，腹腔注射抗氧化剂α-硫辛酸（α-lipoic acid，LA）浓度为15 mg／kg／d，3.0组在接受3.0 mg／m3甲醛暴露同时，腹腔注射同体积的生理盐水。对照组在同样的染毒缸中吸入经过滤的新鲜空气，暴露结束后立即检测各组小鼠肺泡灌洗液中GSH浓度和GSNOR活力。结果表明，3.0mg／m3甲醛暴露小鼠与对照组小鼠相比，其肺泡灌洗液中GSNOR活力极显著上升（p＜0.01），同时GSH浓度极显著下降（p＜0.01）；α-硫辛酸注射组小鼠肺泡灌洗液中GSNOR活力较3.0 mg／m3甲醛暴露小鼠有极显著下降（p＜0.01），同时GSH浓度极显著上升（p＜0.01），小鼠肺泡灌洗液中GSNOR活力与GSH含量呈明显的负相关关系。这提示气态甲醛可以通过GSH途径调节GSNOR表达。甲醛对GSNOR的上调作用可能是通过诱导氧化胁迫进行的，这可能是理解GSNOR在气道中调控的基础。3．抗氧化剂的注射对小鼠肺部GSNOR基因转录的影响细胞对氧化胁迫和氮化胁迫的反应主要在转录的水平得到调控，细胞对氧化胁迫和氮化胁迫的感知是细胞基本的生命活动之一，对细胞生存和基本生理过程有重要意义。为了验证甲醛为了验证甲醛及气道氧化还原状态可在转录水平调控GSNOR表达，研究了甲醛环境暴露和抗氧化剂α-硫辛酸对小鼠肺中GSNOR表达的影响。实验以昆明系小鼠为实验材料，经甲醛染毒和α-硫辛酸注射后立即脱颈处死，取其肺组织提取总RNA，采用RT-PCR二步法将其中GSNOR及管家基因β-actin扩增后通过光密度分析染毒前后基因表转录水平的变化。实验结果表明：与对照组相比，3.0 mg／m3浓度的甲醛可使GSNOR基因转录发生极显著上调（p＜0.01），而α-硫辛酸的注射可拮抗这种上调作用。这些结果提示气态吸入甲醛可在转录水平诱导GSNOR表达上调，而且这种上调与肺部还原状态的改变有关，这可能是理解肺部GSNOR表达的基础。4．甲醛与H2O2对Hela细胞GSNOR活力的影响为进一步研究甲醛对培养细胞GSNOR的诱导作用以及氧化胁迫的可能作用，将Hela细胞暴露于不同浓度液态甲醛和100μmol／L的H2O2，染毒1h，然后检测细胞裂解液中GSNOR酶活力。结果表明，甲醛可依剂量—效应曲线的方式激活GSNOR，导致酶活力升高，其中，高浓度甲醛（1250μmol／L）可导致GSNOR活力显著性上调（与0μmol／L相比，p＜0.05）。同时，高浓度的H2O2对Hela细胞GSNOR活力也有激活作用。这些结果提示，甲醛可诱导哺乳动物细胞GSNOR的上调，并且这种上调可能与氧化胁迫有关。