日本脑炎病毒WHe株基因组特征及其疫苗的研究

论文摘要

日本脑炎（Japanese Encephalitis,JE）,又称流行性乙型脑炎,是由日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）引起的一种中枢神经系统人畜共患急性传染病。其致死率高达30%左右,50%的患者会留下永久性的后遗症,其中,中国的JE发病数占世界总发病数的80%以上。库蚊伊蚊是该病的主要传播媒介,而猪则是重要的传染源和放大器。猪患JE的主要表现为怀孕母猪流产、产死胎、弱仔、公猪睾丸炎及少数仔猪呈神经症状,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前,用于JE免疫预防的疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗两种,其安全性和较高的生产应用成本已成为人们日益关注的问题。近年来,病毒分子生物学和反向遗传学的发展为开发新型JE疫苗提供了新的技术手段。本研究为进一步探索JEV/WHe株基因组功能、致病机理及构建高效新型疫苗,开展了以下工作:1.JEV/WHe株全基因组特征分析本研究设计了11对特异性引物,采用RT-PCR技术扩增得到覆盖JEV/WHe株基因组全长cDNA的11个特异性片段,测序分析表明,JEV/WHe株基因组由一个开放阅读框（ORF,10296个核苷酸）和5’端非编码区（5’LITR,95个核苷酸）和3’端非编码区（3’UTR,585个核苷酸）组成。核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,WHe株与P3株亲缘关系最近,但3’UTR.形成的二级结构与Vellore P20778株3’UTR.形成的二级结构最相似;与黄病毒科其他属成员比较,3’UTR最末端约84个核苷酸所形成的二级结构相当保守。WHe株与P3株的膜蛋白（E）拥有M（76）、G（306）和L（408）三个特有氨基酸,而在其它19株JEV为T（76）、E（306）、S（408）,推测可能与病毒的宿主及组织嗜性有关。WHe株E蛋白中存在控制黄病毒毒力的RGD（387-389）基序,而一部分弱毒株也有该基序,提示JVE毒力型的决定簇具有毒株特异性。由全基因组序列构建的系统发育图与由E基因构建的系统发育图仅有一些细微的差别,表明E基因在研究各分离株之间进化关系中具有重要意义;从GenBank中调出不同时间和地区分离的140株JEV E基因,构建了系统发育图谱。2.JEV/WHe株全长cDNA的长链RT-PCR法扩增采用长链RT-PCR技术扩增基因组全长eDNA。对其进行PCR扩增鉴定,并对含复杂二级结构的3’末端和5’末端非编码区扩增片段进行了测序分析。扩增结果表明,扩增出的JEV WHe株基因组全长cDNA分子近11kb大小:非编码区测序分析表明,扩增产物为WHe株所特有。证明长链RT-PCR法可用于JEV W-He株基因组全长cDNA的扩增。3.JEV/WHe株DNA疫苗载体构建采用RT-PCR.技术扩增prM/E和NSl全基因并进行序列分析,将其分别克隆于真核表达载体pAVXI.,构建的表达载体pAVXlprM/E和pAVXl-NSl,酶切鉴定和序列分析表明,JEV/WHe株DNA疫苗载体构建成功。4.WIte株NSl基因在大肠杆菌中的表达.将NSl基因克隆到pET28b（+）表达载体,构建了pET28b（+）.NSl重组表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,并对其进行了诱导表达,对表达产物进行检测。结果表明,表达产物相对分子质量约为43ku。为JE亚单位疫苗和DNA疫苗的开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 日本脑炎病毒的分子生物学研究进展
• 1.1 JEV 的分类及分型
• 1.2 JEV 分子生物学
• 1.2.1 JEV 的基因组特征
• 1.2.2 JEV 的结构蛋白
• 1.2.3 JEV 的非结构蛋白
• 1.2.4 JEV 基因组RNA5'末端和3'末端非翻译区的结构和功能
• 第二章 长链RT-PCR 技术研究概况
• 2.1 逆转录（Reverse Transcription）
• 2.1.1 RNA 质量和数量
• 2.1.2 逆转录酶
• 2.1.3 反转录产物处理
• 2.2 长链PCR 原理
• 2.2.1 长链PCR 反应条件的优化
• 2.2.2 DNA 聚合酶
• 2.2.3 引物
• 2.2.4 缓冲液
• 2.2.5 Mg2+
• 2.2.6 循环条件
• 2.2.7 添加剂
• 2.2.8 其它因素
• 2.4 长链RT-PCR 技术应用
• 2.4.1 感染性克隆的构建
• 2.4.2 微生物基因组研究
• 2.4.3 基因检测
• 2.5 展望
• 第三章 JEV/WHe 株全基因组序列特征分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要质粒、菌株和毒株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 病毒增殖
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 RNA 提取
• 3.2.4 RT-PCR 反应
• 3.2.5 目的片段的回收
• 3.2.6 感受态细胞与LB 培养基制作
• 3.2.7 目的片段的克隆、转化及重组质粒的筛选与鉴定
• 3.2.8 测序结果分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 RT-PCR 反应
• 3.3.2 WHe 株基因组全长cDNA 的克隆及核苷酸与氨基酸序列分析
• 3.3.3 WHe 株进化分析
• 3.3.4 WHe 株UTR 二级结构的预测与分析
• 3.3.5 E 基因及其氨基酸序列分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 JEV/WHe 株全长cDNA 的长链RT-PCR 法扩增
• 4.1 材料
• 4.1.1 毒株、质粒、菌种、试验动物
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 JEV WHe 株RNA 的提取
• 4.2.3 JEV WHe 株RNA 的RT-PCR 反应
• 4.2.4 JEV WHe 株cDNA 的PCR 鉴定
• 4.2.5 JEV WHe 株cDNA 测序结果分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 长链PCR 最佳反应体系和扩增参数的建立
• 4.3.2 JEV WHe 株全基因组cDNA 的扩增
• 4.3.3 JEV 基因组全长cDNA 的鉴定
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 JEV/WHe 株prME 和N51 基因的克隆及其DNA 疫苗载体的构建
• 5.1 材料
• 5.1.1 主要质粒与菌株
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 引物设计
• 5.2.2 PCR 反应
• 5.2.3 目的片段的回收
• 5.2.4 感受态细胞与LB 培养基制作
• 5.2.5 扩增片段的克隆与转化
• 5.2.6 重组质粒筛选与鉴定
• 5.2.7 重组质粒的序列测定与分析
• 5.2.8 测序结果分析
• 5.2.9 DNA 疫苗载体pVAX1-prME 和pVAX1-N51 的构建
• 5.2.10 prME 和 N51 基因的回收与纯化
• 5.2.11 pVAX1 质粒的大量制备
• 5.2.12 目的基因的克隆与转化
• 5.2.13 pVAX1-prME 和pVAX1-N51 阳性克隆的筛选与鉴定
• 5.2.14 重组质粒的序列测定与分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 prME 和NS1 基因的PCR 扩增
• 5.3.2 prME 和NS1 基因的克隆与鉴定
• 5.3.3 重组DNA 疫苗载体pVAX1-prME 和pVAX1-NS1 阳性克隆的筛选与鉴定
• 5.3.4 重组DNA 疫苗载体pVAX1-prME 和pVAX1-NS1 序列测定与分析
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 JEV /WHe 株N51 基因在大肠杆菌中的高效表达
• 6.1 材料
• 6.1.1 主要试剂
• 6.1.2 主要仪器
• 6.2 方法
• 6.2.1 NS1 基因的克隆与回收
• 6.2.2 原核表达质粒的构建及鉴定
• 6.2.3 细菌的培养与诱导表达
• 6.2.4 表达产物的SDS-PAGE 检测
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 重组表达质粒的构建及鉴定
• 6.3.2 诱导表达产物的SDS- PAGE 电泳检测
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ（缩略词）
• 附录Ⅱ（本文所引用的JEV 分离毒株）
• 致谢
• 作者简介