论文摘要
目的:本课题是构建AFP启动子介导的HSV/TK重组真核表达载体、并研究其对AFP阳性肝癌细胞株的特异性表达作用。同时研究PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体作为肝癌的基因治疗载体的可行性。方法:PCR扩增AFP基因启动子、HSV-TK基因,将上述片断插入EGFP-N1载体的多克隆位点,从而构建甲胎蛋白启动子调控下HSV-TK基因重组表达载体pEGFP-AFP-TK,通过包裹PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体,经其介导,转染AFP阳性肝癌细胞株HepG2和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721,利用增强型绿色荧光蛋白及Western blot法检测目的基因在2种细胞系中的表达。在此基础上测定不同DNA/基因载体的最佳转染效率,取最佳转染效率的DNA/基因载体的复合物比例进行细胞转染,做流式细胞检测比较不同基因转染载体的转染效率。用MTT法检测转染细胞的存活率,结果进行统计学处理。结果:经过PCR扩增得到TK基因、AFP启动子基因片段,再进行连接。长度分别为247bp、1159bp、1381bp,与预期大小一致。并将其连接于EGFP-N1载体送上海吉凯基因公司测序,结果正确。AFP启动子能够驱动下游基因在AFP阳性肝癌细胞株中特异表达。而在AFP阴性肝癌细胞株中不表达。PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体转染率高于脂质体。TK自杀基因对肝癌细胞HEPG2的生长有一定的抑制作用。结论:肝癌特异性真核表达载体pEGFP-AFP-TK构建成功。利用增强型绿色荧光蛋白及Western blot法可以检测到嵌合AFP启动子的pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体能够特异的在AFP阳性的肝癌细胞株表达,而在AFP阴性的肝癌细胞株中基本不表达。纳米磁流体可以将重组真核表达载体pEGFP-AFP-TK转入HEPG2细胞,其转染效率高于传统脂质体。并用噻唑蓝（MTT）法检测表明转染TK自杀基因后对肝癌细胞HEPG2的生长有一定的抑制作用。以上结论为下一步的研究奠定了坚实的基础。
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