利用大肠杆菌和耻垢分支杆菌表达系统制备结核诊断抗原的研究

论文摘要

目的构建结核分支杆菌融合基因lhp-esat6和2×esat-6原核表达载体,分别在大肠杆菌和耻垢分支杆菌中同时诱导表达融合蛋白rCFP10-ESAT6和rdESAT-6,纯化蛋白,Western-blot分析其抗原性,并初步评估其诊断价值。方法以结核分支杆菌H37Rv基因组DNA为模板,经PCR扩增lhp和esat-6基因;用基因延伸拼接技术（SOE）将lhp和esat-6基因体外重组,构建lhp-esat6融合基因,并将其克隆至pET28a和pMF41质粒中分别构建pET28a-lhp-esat6和pMF41-lhp-esat6原核表达载体。以DNA疫苗HG856A2为模板,经PCR扩增2×esat6基因,并将其克隆至pET28a和pMF41质粒中分别构建pET28a-2×esat-6和pMF41-2×esat-6原核表达载体。将pET28a-lhp-esat6和pET28a-2×esat-6重组质粒转化E.coli BL21（DE3）,以IPTG诱导表达融合蛋白rCFP-ESAT6（E.coli）和rdESAT-6（E.coli）。将pMF41-lhp-esat6和pMF41-2×esat-6重组质粒电转化耻垢分支杆菌M.smegmatis,以乙酰胺诱导表达融合蛋白rCFP10-ESAT6（M.smeg）和rdESAT-6（M.smeg）。通过SDS-PAGE鉴定其表达形式,用Ni2+柱亲和层析纯化融合蛋白;用rESAT-6小鼠抗血清对纯化的四种融合蛋白进行Western-blot分析抗原性;用间接ELISA方法检测其抗结核抗体的敏感性和特异性,并以重组蛋白刺激IFN-γ全血试验（IGRA）评估重组抗原在结核病诊断中的价值。结果成功构建了原核表达载体pET28a-lhp-esat6、pET28a-2×esat-6、pMF41-lhp-esat6和pMF41-2×esat-6。融合蛋白在两种表达系统中均以包涵体形式表达;经Ni2+柱亲和纯化的样品SDS-PAGE分析纯度在95%以上,并且四种融合蛋白均可与rESAT-6小鼠抗血清发生特异性反应。间接ELISA检测结果表明:用rCFP-ESAT6纯化蛋白进行结核病血清学诊断的敏感性为25%（5/20）,特异性为95.8%（23/24）;用rdESAT-6纯化蛋白进行结核病血清学诊断的敏感性为30%（6/20）,特异性为95.8%（23/24）,略好于文献报道的rESAT-6结果。结论本研究成功制备了结核分支杆菌的四种融合蛋白,并以此抗原建立了间接ELISA方法用于检测结核抗体试验;以及检测细胞免疫的IGRA试验,为以rCFP10-ESAT6和rdESAT-6为抗原的结核病免疫学诊断试剂研制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 第一章 综述
• 1.1 结核概况
• 1.1.1 结核杆菌的感染与免疫机理
• 1.1.2 BCG与结核病
• 1.2 结核病诊断学研究进展
• 1.3 结核特异性诊断抗原
• 1.4 本研究的内容、目的和意义
• 第二章 利用E.coli表达系统制备rCFP10-ESAT6、rdESAT-6重组蛋白
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶、引物和血清
• 2.1.3 试验试剂与仪器设备
• 2.1.4 E.coli感受态细胞的制备
• 2.2 重组蛋白的表达、纯化及其抗原性分析
• 2.2.1 lhp-esat6和2×esat-6融合基因的扩增
• 2.2.1.1 lhp-esat6基因片段的扩增
• 2.2.1.2 2×esat-6基因片段的扩增
• 2.2.2 pET28a-lhp-esat6和pET28a-2×esat-6重组质粒的构建
• 2.2.3 重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析
• 2.2.4 重组蛋白的纯化、透析及其抗原性分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 lhp-esat6和2×esat-6融合基因的获得
• 2.3.2 pET28a-lhp-esat6和pET28a-2×esat-6重组质粒的鉴定
• 2.3.3 SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达情况
• 2.3.4 重组蛋白的纯化及其抗原性分析
• 2.3.4.1 重组蛋白的纯化
• 2.3.4.2 重组蛋白的免疫印迹鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 利用M.smeg表达系统制备rCFP10-ESAT6、rdESAT-6重组蛋白
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 酶、引物和血清
• 3.1.3 试验试剂与仪器设备
• 3.1.4 M.smeg感受态细胞的制备
• 3.2 重组蛋白的表达、纯化及其抗原性分析
• 3.2.1 lhp-esat6和2×esat-6融合基因的扩增
• 3.2.1.1 lhp-esat6基因片段的扩增
• 3.2.1.2 2×esat-6基因片段的扩增
• 3.2.2 pMF41-lhp-esat6和pMF41-rdesat-6重组质粒的构建
• 3.2.2.1 pBluescript SK-lhp-esat6和pBluescript SK-2×esat6亚克隆
• 3.2.2.2 pMF41-lhp-esat6和pMF41-2×esat6质粒的构建与转化
• 3.2.3 重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析
• 3.2.4 重组蛋白的纯化、透析及其抗原性分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 lhp-esat6和2×esat-6融合基因的获得
• 3.3.2 pMF41-lhp-esat6和pMF41-2×esat-6重组质粒的鉴定
• 3.3.3 SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达情况
• 3.3.4 重组蛋白的纯化及其抗原性分析
• 3.3.4.1 重组蛋白的纯化
• 3.3.4.2 重组蛋白的抗原性分析
• 3.4 讨论
• 第四章 重组蛋白在结核病诊断中的初步应用
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 临床血清样本
• 4.1.2 检测试剂与材料
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 重组蛋白的应用诊断试验
• 4.2.1 ELISA方法的建立
• 4.2.2 重组蛋白刺激IFN-γ全血试验
• 4.2.2.1 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离
• 4.2.2.2 淋巴细胞体外培养
• 4.2.2.3 双抗体夹心ELISA检测IFN-γ
• 4.3 重组蛋白诊断应用结果分析
• 4.3.1 重组蛋白ELISA检测血清的特异性和敏感性
• 4.3.2 重组蛋白刺激IFN-γ ELISA结果分析
• 4.4 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间的研究成果