纳豆激酶基因在酿酒酵母中表达的研究

论文摘要

纳豆激酶（nattokinase，NK）是一种具有很强纤维蛋白溶解作用的酶，可作为一种很有前景的新型药物予以开发。而酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种简单的单细胞真核生物，它没有内毒素，无致病性，被美国食品和药物管理局（FDA）确认为一种安全生物，是酿造、食品、饲料等领域应用最广泛的工业微生物之一。本研究通过对纳豆激酶基因的PCR扩增、连接、转化，筛选出pMD18T-NK阳性克隆重组子，测序结果表明克隆的纳豆激酶基因的大小为1192bp，共编码397个氨基酸，与NCBI上公布的与纳豆激酶基因同源率较高的序列进行比对，表明纳豆芽胞杆菌中的纳豆激酶基因与枯草芽胞杆菌（NCBI登录号为AY219901.1）的同源性高达95％，而与豆豉菌来源的（NCBI登录号为DQ178658.1）同源性仅为69％；这说明进一步研究纳豆芽孢杆菌纳豆激酶基因与豆豉菌纳豆激酶基因的差异导致功能上的差别还有一定的空间。继而纳豆激酶基因与pYES2连接，转化至H158感受态细胞，质粒小量提取后，单酶切、双酶切对重组阳性质粒进行鉴定，β-半乳糖诱导成功转化的重组菌株H158-NK，使其表达，用纤维蛋白平板检测出了重组菌H158-NK的发酵上清液具有纤溶活性。具有纤溶活性的重组H158-NK的成功构建，为筛选含目的基因的酿酒酵母表达体系提供依据和思路，为后续建立高效的酵母遗传转化体系、以食品作为生物反应载体来获取纳豆激酶蛋白提供一条新途径，为开发可直接食用型溶栓NK产品、微生态制剂或新型心脑血管疾病保健品奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 纳豆激酶研究进展
• 1.1.1 纳豆激酶的由来及功用
• 1.1.2 纳豆激酶的性质及结构
• 1.1.3 纳豆激酶国内外分子生物学研究进展
• 1.1.4 纳豆激酶溶栓机制及活性测定方法
• 1.1.5 纳豆激酶发展前景展望
• 1.2 酿酒酵母基因工程研究进展
• 1.2.1 酿酒酵母基因工程的载体系统
• 1.2.2 YEp酵母附加体型质粒的产生和特性
• 1.2.3 酿酒酵母的转化方法
• 1.2.4 影响酵母表达的因素
• 1.2.5 酿酒酵母发展展望
• 1.3 本课题的目的与意义
• 2 纳豆激酶基因的克隆和序列分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种来源及质粒来源
• 2.1.2 实验药品
• 2.1.3 实验器材
• 2.1.4 PCR引物
• 2.2 实验试剂的配制
• 2.2.1 培养基配制方法
• 2.2.2 提DNA溶液配制方法
• 2.2.3 电泳缓冲液配制方法
• 2.2.4 质粒提取溶液配方
• 2.2.5 STET（pH8.0）的配方
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 纳豆芽孢杆菌1.1086的活化
• 2.3.2 纳豆芽孢杆菌1.1086溶栓活性的测定
• 2.3.3 纳豆激酶基因克隆体系的构建
• 2.4 实验结果及分析
• 2.4.1 纳豆芽孢杆菌1.1086溶栓活性的测定
• 2.4.2 纳豆芽孢杆菌1.1086基因组DNA的提取
• 2.4.3 目的基因的PCR扩增
• 2.4.4 重组克隆转化子的鉴定
• 2.4.5 T simple-NK重组子的序列检测
• 2.5 讨论
• 3 纳豆激酶在酿酒酵母中的表达和活性测定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌种及质粒来源
• 3.1.2 实验药品
• 3.1.3 实验器材
• 3.2 实验试剂的配制
• 3.2.1 培养基配方
• 3.2.2 缓冲液等试剂的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 重组表达载体pYES2-NK的构建
• 3.3.2 重组质粒pYES2-NK转化酿酒酵母H158
• 3.3.3 重组酵母菌H158-NK的诱导表达
• 3.3.4 重组酵母菌H158-NK溶栓活性的检测
• 3.4 实验结果及分析
• 3.4.1 重组表达载体pYES2-NK的构建
• 3.4.2 重组质粒pYES2-NK转化酿酒酵母H158
• 3.4.3 重组酵母菌溶栓活性的检测
• 3.5 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢