基于cDNA-AFLP的茉莉酸甲酯刺激的三七不定根转录轮廓研究

论文摘要

三七是一种重要的传统中草药,具有活血化瘀、镇静止痛、滋补强壮等多重功效,现代药理学研究揭示三七具有广泛的药理活性和广阔的应用前景。由于栽培限制因素多、细胞或组织培养尚无商业应用,三七的产量供不应求。代谢工程生产活性成分是三七研发的重要突破口之一,然而其成功应用取决于对这些活性成分生物合成途径及其调控机制的深入认识。由于缺乏基因组学数据,SAGE、microarray等常用的基因表达研究工具在非模式植物中难以应用,而cDNA-AFLP因不需要事先知道基因组序列信息,特别适合于遗传背景资料缺乏的非模式植物的基因表达分析及新基因的发掘。在茉莉酸甲酯刺激下,三七不定根主要活性成分三萜皂苷含量提高。为了深入探索三七中三萜皂苷生物合成机制,本研究用茉莉酸甲酯刺激三七不定根,考察了影响三七不定根的cDNA-AFLP反应体系的各个关键因素,包括总RNA提取、双链cDNA的合成、内切酶组合用量和反应时间、连接接头用量、预扩增和选择性扩增模板稀释倍数、选扩增引物的浓度等,建立了适合三七不定根的cDNA-AFLP优化反应体系,同时建立了基于ABI xl 3730测序仪的选择性扩增片段分离定量检测平台。应用建立的cDNA-AFLP优化反应体系,结合主成分分析、偏最小二乘法-判别分析方法,分析了茉莉酸甲酯刺激下的三七不定根的转录轮廓,证实了茉莉酸甲酯刺激对三七不定根基因表达的影响,初步探索了刺激后基因表达的变化规律并寻找了差异性转录本片段。实验结果证实,这种方法稳定可行,可被广泛应用到其他非模式植物中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 三七概况
• 1.2 茉莉酸类诱导剂
• 1.2.1 简介
• 1.2.2 茉莉酸类化合物对次生代谢产物的调控
• 1.3 皂苷生物合成途径及相关基因的研究进展
• 1.4 cDNA-AFLP
• 1.5 功能基因组学的研究进展
• 1.6 课题立项背景与意义
• 1.7 本文的主要工作
• 参考文献
• 第二章 三七不定根cDNA-AFLP反应体系的建立与优化
• 2.1 引言
• 2.2 实验器材
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 三七不定根总RNA 提取
• 2.3.2 cDNA 合成
• 2.3.3 内切酶消化
• 2.3.4 连接
• 2.3.5 预扩增
• 2.3.6 选择性扩增
• 2.3.7 ABI xl 3730 扩增片段的分离定量检测
• 2.4 实验结果与讨论
• 2.4.1 总RNA
• 2.4.2 cDNA 合成
• 2.4.3 内切酶消化
• 2.4.4 连接
• 2.4.5 预扩增
• 2.4.6 选择性扩增
• 2.4.7 选择性扩增片段分离定量检测
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 三七不定根转录轮廓分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验器材
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验试剂
• 3.2.3 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 cDNA-AFLP 分析
• 3.3.2 数据分析
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 毛细管电泳凝胶图
• 3.4.2 主成分分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 研究总结与展望
• 4.1 研究工作总结
• 4.1.1 三七不定根cDNA-AFLP 方法的建立
• 4.1.2 基于ABI xl 3730 的扩增片段分离定量检测方法的建立
• 4.1.3 茉莉酸甲酯刺激的三七不定根转录轮廓分析
• 4.2 论文创新点
• 4.3 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文
• 致谢