论文摘要
一、研究背景鼻咽癌是我国南方诸省及东南亚发病率高,危害大的恶性肿瘤之一。遗传因素及包括EB病毒（Ebstein Barr病毒）在内的环境因素可能是鼻咽癌发病中最具危险性的因素。鼻咽癌治疗以放疗为主,辅以化疗等方法。近年来虽然放疗及化疗在设备和技术上取得了很大的进步,但鼻咽癌的5年生存率仍维持在50%左右。此外,放化疗带来的全身及局部副作用给病人的身心造成了极大的伤害,并未从根本上改善治疗效果。因此,探索鼻咽癌的病因及新的安全有效的治疗方法成为鼻咽癌治疗的瓶颈。包括鼻咽癌在内的绝大多数恶性肿瘤与端粒酶活性及其亚单位hTERT （human telomerase reverse transcriptase）活性增高有密切关系。以端粒酶为靶点的肿瘤靶向基因治疗成为有希望的治疗方法之一,因而,探寻端粒酶抑制剂成为新的热点研究之一。近年来,一个潜在的端粒酶抑制剂-PinX1 （Pin2/TRF1 interacting protein 1）基因被发现。它存在于正常人体组织中,而在肿瘤组织中则相应的低表达或不表达。PinX1基因对肿瘤细胞端粒酶／端粒的调控作用机制比较复杂。一些研究发现,PinX1基因能够抑制胃癌及肝癌细胞中的端粒酶活性从而诱导肿瘤细胞凋亡。另一些研究提示,在白血病中,PinX1基因与端粒酶活性存在正相关。还有一些在前列腺癌、胃肠道癌及髓母细胞瘤的研究中认为,PinX1并非抑制端粒酶的关键因素,可能是基因的多态性现象。最新研究表明,PinX1作为微管结合蛋白对稳定染色体有重要作用。总之,PinX1基因在不同肿瘤中的作用机制可能不同。目前PinX1基因是否对鼻咽癌有抑制端粒酶活性及诱导肿瘤细胞凋亡的作用尚未见报道,我们以此为切入点,结合已有的研究基础,成功构建PinX1基因表达载体pEGFP-C3-PinXl及针对PinX1基因的小干扰RNA（PinX1-FAM-siRNA）,并进行了深入研究,将其转染有高转移高成瘤潜能的人鼻咽癌细胞5-8F,观察PinX1的mRNA表达变化,对细胞体外增殖、迁移及愈合能力的影响,对端粒酶活性及细胞周期和凋亡的影响,为探讨PinX1基因的内在调节机制,为鼻咽癌的基因治疗提供理论依据。二、研究目的构建PinX1基因表达载体pEGFP-C3-PinX1及针对PinX1基因的小干扰RNA（PinX1-FAM-siRNA）,将其转染有高转移高成瘤潜能的人鼻咽癌细胞5-8F,观察PinX1的mRNA表达变化,对细胞体外增殖、迁移及愈合能力的影响,对端粒酶活性及细胞周期和凋亡的影响,探讨PinX1基因调控端粒酶活性表达对人鼻咽癌细胞5-8F凋亡的作用和意义。三、实验方法1.细胞株人鼻咽癌细胞5-8F及人脐静脉细胞ECV-304均由南方医科大学细胞生物学教研室惠赠。2.细胞培养将人鼻咽癌5-8F细胞株在RPMI 1640培养液以及人脐静脉细胞ECV-304在DMEM培养液（含10%新生牛血清,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml）中,37℃、5%C02培养箱中培养,常规消化传代,选取处于指数生长期细胞进行试验。3.质粒构建及提取pEGFP-C3-PinX1、pEGFP-C3表达质粒由武汉三鹰生物技术有限公司构建,能编码增强型绿色荧光蛋白EGFP,在E.coli及真核细胞中表现卡那霉素抗性。该载体大小为4700bp,将质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素抗性克隆,双向测序鉴定重组质粒。大量摇菌扩增后,抽提质粒纯化。4. siRNA体外化学合成针对PinX1基因序列,采用Invitrogen公司在线软件（http://maidesigner.Invitrogen.com/,maiexpress/）设计候选的siRNA序列,同时进行人类基因组BLAST搜索及同源性分析,最后挑选3个候选序列作为实验之用,分别为PinX1-963、PinX1-695、PinX1-242,本实验证实PinX1-695为有效siRNA,该序列sense:5’-GUAAAGAUGUGGAAAGUUATT-3’, antisense: 5’-TTCAUUUCUACACCUUUCAAU-3’.5.实验分组及细胞转染本实验分五组：A组：pEGFP-C3-PinX1组（转染带PinX1基因的质粒）；B组：pEGFP-C3组（转染不带PinX1基因的空质粒）；C组：脂质体组（只加脂质体）；D组：空白细胞组（常规培养的5-8F细胞,不加任何干扰因素）；E组：PinX1-FAM-siRNA组（转染针对PinX1基因的小干扰RNA）。细胞培养至对数生长期,接种到24孔细胞培养板中,用不含抗生素的培养基常规培养24h后（细胞密度约为80%-90%）,用脂质体Lipofectamine2000TM分别转染pEGFP-C3-PinX1、pEGFP-C3质粒和PinX1-FAM-siRNA, C组单加脂质体,具体操作参照说明书进行。转染24-48h后倒置荧光显微镜下观察细胞荧光。6. RT-PCR测定PinX1 mRNA的表达水平用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA,采用AMV逆转录合成cDNA, PinX1上游引物为5’-TTTT CTCGAG ATG TCT ATG CTG GCT GAA CG-3’,下游引物为5’-TTTT GAATTC TCA TTT GGA ATC TTT CTT C-3’,扩增产物长度为987bp。GAPDH作为内参照,上游引物为5’GGAAGATGGTGATGGGATT3’下游引物为5’GGATTTGGTCGTATTGGG 3’,扩增产物长度为205bp。PCR反应条件为：94℃预变性2min,94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,共25个循环,最后72℃再延伸5min。电泳后UVI凝胶成像系统摄像, Quantity one软件分析条带灰度值,用PinX1/GAPDH代表PinX1 mRNA的相对表达量。7.MTT检测细胞增殖能力MTT法分析不同时间点的细胞活力（0h、24h、48h、72h）,每个时间点分别检测6个复孔。测量各组的OD490nm值,绘制生长曲线,并计算各组的生长抑制率。细胞生长抑制率（IR）=（对照组OD490—干扰组OD490）/对照组OD490×100%。8. RT-PCR测定hTERTmRNA的表达水平用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA,采用AMV逆转录合成cDNA。hTERT上游引物为5’-CCGAGTGACCGTGGTTTCTGTG-3’,下游引物为5’-GGAAGCGGCGTTCGTTGTG-3’,扩增产物长度为670bp。GAPDH作为内参照,上游引物为5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’,下游引物为5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’,扩增产物长度为205bp。反应条件为：94℃预变性4min,94℃变性30s,49℃退火30s,72℃延伸45s,共30个循环,最后72℃再延伸5min。电泳后UVI凝胶成像系统摄像,Quantity one软件分析条带灰度值,用hTERT/GAPDH代表hTERT mRNA的相对表达量。9. Stretch PCR法检测细胞端粒酶活性采用日本东洋纺生物科技有限公司的TeloChaser试剂盒,将对数生长期的5-8F细胞（1×106/孔）接种到六孔培养板中,培养24h后,分别将质粒pEGFP-C3-PinX1, pEGFP-C3,脂质体以及PinX1-FAM-siRNA转染5-8F细胞,48h后采用Stretch PCR法检测细胞端粒酶活性,比较转染前后细胞端粒酶活性的改变,同时检测对照细胞ECV-304的端粒酶活性。具体方法参照试剂盒说明书操作。10. Transwell小室趋化运动实验取对数生长期细胞,用无血清RPMI1640培养过夜。消化,PBS洗涤,离心,弃上清,将细胞重悬于RPMI1640中,调整细胞浓度为1×105/mL,用按200μL/上室加入细胞悬液,下室每室加5001μL含10%新生牛血清（作为趋化因子）的RPMI-1640培养液。37℃5%C02培养24h后,取出上室,用棉签擦去膜上室面的细胞,4%多聚甲醛固定膜下室面的细胞15min,1×PBS清洗3次,每次5min,结晶紫染色3min,1×PBS清洗干净,吹风机干燥膜。细胞迁移性结果表示为穿过聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下每个复孔上、下、左、右、中随机取5个高倍镜视野计数（400x）。11.划痕愈合实验取对数生长期细胞,细胞接种于6孔板,培养至细胞呈单层贴壁生长状态。用100μL的tip头在各组单细胞层上划痕,用含10% FBS的培养基继续培养以使划痕愈合。分别于划痕后0h、12h、24h、36h每个孔取4个视野拍照,观察划痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[（愈合前两侧细胞层距离-愈合后两侧细胞层距离）/愈合前两侧细胞层距离]×100%。12.流式细胞仪测细胞周期和凋亡取对数生长期细胞,转染48h后收集细胞（1×106/样品）,PBS洗涤细胞。用PBS重悬细胞,调整细胞浓度为1×106ml, Annexin V/PI（碘化丙锭溶液）染色,避光15min,流式细胞仪分析细胞凋亡情况,凋亡指数（AI）=（凋亡细胞数/癌细胞总数）×100%；另外用冰预冷的75%乙醇4℃固定经PBS洗涤的细胞样品后测细胞周期。13.统计学分析采用SPSS13.0统计分析软件包进行数据处理,半定量RT-PCR、端粒酶活性检测、细胞趋化运动实验、细胞周期凋亡实验的显著性检验采用One-Way ANOVA方差分析,方差齐性的多重比较采用LSD法,方差不齐的多重比较用Dunnett’s T3法。细胞增殖实验（MTT）和划痕愈合实验采用两因素析因设计的方差分析,多重比较用SNK法。同一时间点不同组间的比较和同一组内不同时间点的比较One-Way ANOVA方差分析。参数比较均先进行方差齐性检验,若方差不齐,用基于方差不齐的近似F检验Welch法。P<0.05表示差异有统计学意义。四、实验结果1.质粒构建及鉴定成功构建PinX表达载体pEGFP-C3-PinXl,双向测序鉴定证实序列完全正确。2.细胞瞬时转染后荧光显微镜观察各组均见有绿色荧光细胞,约占细胞总数的80%。3. RT-PCR检测细胞PinX1 mRNA的表达量5组鼻咽癌细胞5-8F,前4组均能扩增出987bp的PinX1基因片段,条带强弱不一致。与D组相比,A组转染带PinX1基因的质粒后,PinX1 mRNA的表达水平显著上调（P<0.05）,表明质粒能有效的上调PinX1基因的表达；E组转染针对PinX1基因的小干扰RNA后,PinX1 mRNA的表达水平下调了70%,有效地沉默了PinX1基因的表达,B、C、D组之间PinX1 mRNA的表达无显著性差异（P>0.05）,提示处理过程中空白质粒pEGFP-C3和脂质体对细胞PinX1 mRNA的表达无影响。4.细胞增殖实验结果结果发现,组间差异有统计学意义（F=35.870,P=0.000）,不同组间的活细胞数不同。不同时间点的差异也有统计学意义（F=437.621,P=0.000）,活细胞数随时间延长而显著增多。时间与组别间存在交互效应（F=4.592,P=0.000）,说明五组间的差异随时间变化而变化。逐一分析个因素的单独效应,A组的OD490值（X=2.15）显著低于D组和E组（X=2.52,X=2.50）,表明pEGFP-C3-PinX1对5-8F细胞增殖呈显著的抑制作用,而PinX1-FAM-siRNA对5-8F细胞增殖无显著影响。以细胞在不同时间点（0h、24h、48h、72h）的OD490值绘制细胞生长曲线,并计算出的生长抑制率5.细胞迁移能力的检测结果显示组间差异有统计学意义（F=17.162,P=0.000）,表明不同的处理对5-8F细胞的迁移运动能力影响不同。pEGFP-C3-PinX1上调PinX1表达后,5-8F细胞的趋化运动性降低（与空白细胞组相比,P=0.000）。其它pEGFP-C3,脂质体、PinX1-FAM-siRNA三种处理对细胞趋化活动性无显著作用（与空白细胞组相比,均有P>0.05）。6.划痕实验检测细胞愈合能力采用两因素析因设计的方差分析进行划痕实验结果分析,组间差异有统计学意义（F=182.366,P=0.000）,pEGFP-C3-PinX1组的划痕愈合率（X=31%）显著低于空白细胞组（X=50%）,提示PEGFP-C3-PinXl组上调PinX1的表达能抑制细胞的愈合能力；而PinX1-FAM-siRNA组与空白细胞组的划痕愈合率差异无统计学意义（P=0.083）,表明siRNA沉默上调PinX1基因的表达对细胞的愈合能力无显著影响。7. hTERT mRNA的表达水平和端粒酶活性检测结果结果显示组间差异有统计学意义。转染pEGFP-C3-PinX1上调PinX1表达后,5-8F细胞的hTERT mRNA表达降低（降低了29.9%）,端粒酶活性降低（与正常5-8F相比,P=0.000）。其它pEGFP-C3、脂质体、PinX1-FAM-siRNA三种处理对细胞hTERT mRNA的表达和端粒酶活性无显著作用（均有P>0.05）。8.细胞周期和凋亡情况（1）细胞周期单因素方差分析细胞G0/G1期细胞百分数,pEGFP-C3-PinXl处理的5-8F细胞G0/G1期细胞百分数显著增加（与空白细胞组相比,P=0.000）,细胞被阻滞在G0/G1期。其它各种处理对5-8F细胞的GO/G1期细胞百分数无显著影响（P>0.05）。（2）凋亡分析AnnexinⅤ（-）/PI（-）为活细胞（左下象限）,AnnexinⅤ（+）/PI（-）为早期凋亡细胞（右下象限）,AnnexinⅤ（-）/PI（+）为晚期凋亡细胞（右上象限）,凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/总细胞数=早期凋亡指数+晚期凋亡指数。组间差异有统计学意义（F=66.489,P=0.000）。pEGFP-C3-PinXl组转染后细胞凋亡指数较空白对照细胞组显著升高（与空白细胞组比较,P=0.006）,提示PinX1基因能促进细胞的凋亡,转染48h凋亡指数达（49.73±2.70%）。pEGFP-C3组、脂质体组、PinX1-FAM-siRNA组与空白细胞组细胞凋亡指数无显著性差异（P>0.05）,提示这三种处理对细胞凋亡无显著影响。五、结论转染外源PinX1基因可显著下调鼻咽癌细胞中端粒酶活性及其hTERT mRNA表达,抑制该肿瘤细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡。而沉默PinX1基因的表达可以抵消PinX1基因的上述作用,即对细胞端粒酶活性、hTERT mRNA的表达以及细胞增殖迁移、细胞凋亡的作用。表明PinX1基因是一个潜在的端粒酶活性抑制剂,可能通过靶向调控端粒酶途径来抑制鼻咽癌细胞的增殖发展,本研究将为鼻咽癌的靶向基因治疗开辟新领域。