论文摘要
根据已知H5N1亚型人源高致病性禽流感安徽株HA、M2基因序列设计合成克隆引物,用特异性引物进行PCR扩增HA和M2基因,将其克隆到pMD18-T Vector,经测序及酶切鉴定正确。将目的基因克隆到pVRC表达载体上,分别命名为pVRC-HA/YS/K和pVRC-M2/YS/K,经酶切与测序鉴定为正确克隆。使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000在MDCK或293FT细胞中进行瞬时表达。通过间接免疫荧光,Western Blot分析确定目的基因的正确翻译与表达。根据哺乳动物细胞偏性,使目的基因在人源化细胞中高效表达为主要原则,对HA基因进行密码子优化,将优化后的HA基因片段人工合成,并命名为HA/YH/K,将HA/YH/K克隆入pVRC表达载体中,命名为pVRC-HA/YH/K。使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000在MDCK或293FT细胞中进行瞬时表达,通过间接免疫荧光,Western Blot分析确定该基因的正确翻译与表达。以细胞骨架中actin蛋白为内参比,分析比较pVRC-HA/YH/K和pVRC-HA/YS/K在相同条件下HA蛋白表达量的高低。将HA/YH/K基因片段与M2/YS/K基因片段克隆入pIRES表达载体中,构建可同时表达HA与M2蛋白的双顺反子表达载体,并命名为pIRES-HA/YH/K-M2/YS/K,用阳离子脂质体Lipofectamine 2000在293FT细胞中进行瞬时表达,通过间接免疫荧光,Western Blot研究和鉴定该基因的正确翻译与表达。将H5N1亚型人源高致病性禽流感病毒中国安徽株HA基因和M2成功克隆入克隆载体与真核表达载体上,酶切鉴定和测序均正确;构建的真核表达载体pVRC-HA/YH/K,pVRC-HA/YS/K和pVRC-M2/YS/K,pIRES-HA/YH/K-M2/YS/K在真核细胞中翻译表达正确,蛋白大小与报道一致。密码子优化后的HA基因在蛋白表达量上明显优于没有优化的HA基因;双顺反子表达载体pIRES-HA/YH/K-M2/YS/K可同时正确翻译与表达HA与M2蛋白,但表达量上共同表达的目的基因低于单独表达的目的基因。本试验构建的H5N1亚型人源高致病性禽流感病毒HA和M2基因的真核表达载体,体外转染真核细胞并检测目的蛋白的表达,为进一步开展人源高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感疫苗研发奠定基础,同时为应对流感大流行做好应急储备。
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标签：人源高致病性禽流感论文; 蛋白论文;