论文摘要
第一部分Ⅰ型前庭毛细胞改良分离法目的探讨一种能提供更多数量并更长时间保留单离豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞（VHCⅠ）细胞活性的分离方法。方法将耳廓反射正常的杂色豚鼠随机分为4组,每组12只,分别为0.25%胶原酶Ⅳ+常用分离法组（A组）,0.05%胰蛋白酶+常用分离法组（B组）,0.25%胶原酶Ⅳ+改良分离法组（C组）和0.05%胰蛋白酶+改良分离法组（D组）分离豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞,通过光镜、膜片钳、胞内钙成像等方法观察、鉴定和评价VHCⅠ活性。结果A组平均每耳分离出存活单离VHCⅠ25个,镜下可见成簇的细胞团块,3h后存活细胞约14个,6h后存活细胞约8个,3h膜片钳测得静息电位平均为-55±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为105±15nmol/ L; B组平均每耳分离出存活单离VHCⅠ40个, 3h后存活细胞约19个,6h后存活细胞约6个,3h膜片钳测得静息电位平均为-60±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为95±10nmol/ L; C组平均每耳分离出存活单离VHCⅠ24个,3h后存活细胞约17个,6h后存活细胞约11个,3h膜片钳测得静息电位平均为-55±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为95±15nmol/ L;D组平均每耳分离出VHCⅠ42个,镜下成簇细胞团块较少,细胞与组织离解充分,3h后存活细胞约32个,6h后存活细胞约23个, 3h膜片钳测得静息电位平均为-60±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为90±10nmol/ L,且胞内钙离子浓度更稳定。结论以胰蛋白酶酶解结合改良式液体外加机械分离技术分离方法简便易行,能提供足够量的存活时间较长的单离豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞,适用于对细胞活性要求较高的实验如膜片钳电生理研究等。第二部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上存在胆碱能受体通道目的探讨豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在。方法应用全细胞膜片钳技术检测豚鼠急性分离的Ⅰ型前庭毛细胞（vestibular hair cell typeⅠ, VHCⅠ）对乙酰胆碱（acetylcholine , ACh）的反应特性及其浓度依赖性。结果7.5%（21/279）的Ⅰ型前庭毛细胞对10～1000μmol/L的ACh敏感,对ACh的反应呈浓度依赖性（EC50=63.78±2.31μmol/L）。结论部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上存在胆碱能受体,胞外给予ACh（10～1000μmol/L）可激活一持久缓慢的外向电流,Ⅰ型前庭毛细胞的胆碱能受体通道对于ACh的作用呈现浓度依赖性。第三部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱能受体通道电生理特性的研究目的对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱能受体介导的离子通道的特性进行研究。方法应用全细胞膜片钳技术,检测豚鼠急性分离的Ⅰ型前庭毛细胞（vestibular hair cell typeⅠ, VHCⅠ）对乙酰胆碱（acetylcholine , ACh）的电流特性。结果豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱受体诱发电流为非电压依赖性。在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol/L乙酰胆碱激活一持久缓慢的外向电流,电流幅值为170±15pA。VHCⅠ的再次激活时间不小于1min。在长时间暴露在ACh的情况下,受体离子通道不会发生自发性关闭。结论胞外给予ACh（10～1000μmol/L）部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上可激活一持久缓慢的外向电流,Ⅰ型前庭毛细胞的胆碱能受体通道对于ACh的作用呈现外钙依赖性,非电压依赖性或失敏性。第四部分胆碱能激动剂对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞内钙离子浓度的影响目的通过观察胆碱能受体激动剂对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞（VHCⅠ）胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,探讨前庭毛细胞膜所存在的胆碱能受体及其分型,检验该细胞上胆碱能受体的脱敏现象。方法用胰蛋白酶消化结合机械分离法,分离豚鼠VHCⅠ,荧光探针Fura-2染色后在荧光倒置显微镜下记录VHCⅠ胞内游离钙离子浓度的动态变化。结果①非选择性胆碱能受体激动剂乙酰胆碱（ACh）、M型胆碱能受体激动剂毒蕈碱（muscarine）在正常细胞外液中均可引起大部分（21/25, 14/18）单离VHCⅠ[Ca2+]i的升高,但无钙外液中ACh、muscarine仅使少部分（3/20,2/16）VHCⅠ[Ca2+]i升高且作用减弱;正常外液中,N型受体激动剂尼古丁（nicotine）仅在高浓度（≥10 mmol/L）时引起部分（7/32） VHCⅠ[Ca2+]i升高,在低浓度时对胞内钙离子浓度影响不明显,无钙外液中,10 mmol/L nicotine对胞内钙离子浓度影响不明显。②ACh引起VHCⅠ内[Ca2+]i升高在同一细胞可重复出现,不存在脱敏现象③M型胆碱能受体拮抗剂阿托品（atropine）可抑制ACh引起的VHCⅠ[Ca2+]i的升高,N型胆碱能受体拮抗剂筒箭毒素（d-TC）对ACh引起的VHCⅠ[Ca2+]i的升高具有竞争性抑制作用。④分别以m1、m2、m3、m4型胆碱能受体拮抗剂pirenzepine、methoctramine、4-DAMP、tropicamide预孵育VHCⅠ5min后胞外给予ACh,均可引起[Ca2+]iratio值升高幅度降低,但pirenzepine、4-DAMP和tropicamide对ACh对再次引起VHCⅠ[Ca2+]iratio值升高的抑制作用不明显,methoctramine预孵育后细胞的[Ca2+]i ratio的升高幅度较首次正常外液中给予100μmol/L ACh后[Ca2+]iratio值升高幅度降低约35±10%。结论豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞膜上存在M型和N型两种亚型的胆碱能受体,ACh对VHCⅠ内[Ca2+]i升高的作用主要以激动m2型胆碱能受体为主;胞外钙内流是[Ca2+]i升高的主要途径;豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞膜上的胆碱能受体对乙酰胆碱无脱敏现象。第五部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上乙酰胆碱敏感性电流的胞内信号转导机制目的本文探讨了豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱能受体介导的乙酰胆碱敏感性电流胞内信号转导机制。方法应用膜片钳技术检测急性分离的豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞（vestibular hair cell typeⅠ, VHCⅠ）上乙酰胆碱敏感性电流的胞内信号转导机制。结果在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol/L乙酰胆碱在豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上激活一持久缓慢的外向电流,大电导钙依赖性钾通道（BK）选择性阻断剂北非蝎毒素（CTX）可大幅度抑制IACh,小电导钙依赖性钾通道（SK）选择性阻断剂蜂毒明肽（apamin）对IACh的影响不明显,IACh可被M型胆碱能受体拮抗剂阿托品（atropine）和N型胆碱能受体拮抗剂筒箭毒素（d-TC）竞争性抑制; m2型胆碱能受体选择性拮抗剂methoctramine可抑制VHCⅠ上引发的IACh,m1、、m3、m4型胆碱能受体拮抗剂pirenzepine、4-DAMP、tropicamide对VHCⅠ上IACh作用不明显;G蛋白抑制剂百日咳毒素（PTX）可使IACh幅值减小,非水解性GTP类似物GTP-γ-s可增大IACh幅值; IP3受体拮抗剂肝素（heparin）,PKG抑制剂KT5823,PKC特异选择性抑制剂BIM对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上IACh的影响不明显,PKA抑制剂H-89可明显抑制IACh,胞外应用PKA激动剂forskolin可激活一类似IACh电流;胞外应用cAMP膜可渗透性类似物db-cAMP可激活一类似IACh电流,cGMP膜可渗透性类似物8-BrcGMP不能产生类似电流,PLC抑制剂U73122对IACh的作用不明显。结论ACh在VHCⅠ上主要作用于m2型胆碱能受体,激活一BK电流,该BK电流在胞内由m2型胆碱能受体偶联的G蛋白-cAMP-PKA通路介导。