腺病毒介导的PEDF基因抑制大鼠脉络膜新生血管的实验研究

论文摘要

目的：研究腺病毒介导的色素上皮衍生因子基因（AdPEDF）对挪威（Brown Norway，BN）大鼠脉络膜新生血管（Choroidal neovascularization，CNV）的抑制作用；观察CNV减少或消退的变化规律；并比较不同给药方式的治疗效果，从而明确药物疗效及最佳给药途径，为进一步基因治疗临床实验奠定基础。方法：选取6～8周雌性BN大鼠68只（136只眼），从中随机选取4只大鼠（8只眼）作为空白对照组（N组），其余64只大鼠（128只眼）作为实验组。根据给药方式不同将实验组随机分为4组：玻璃体腔注射给药组（A组）、玻璃体腔注射对照组（B组）、球旁注射给药组（C组）、球旁注射对照组（D组），每组16只大鼠（32只眼），再根据给药后观察时间不同，将每组随机分为4个亚组：3天组、7天组、14天组、28天组，每个亚组4只大鼠（8只眼）。所有大鼠通过氪离子激光光凝建立脉络膜新生血管模型，激光参数为波长647nm，功率350～380mW，光斑直径50μm，曝光时间0.05s。N组：光凝后14天不做任何处理，只用于与两实验组给药后眼底荧光血管造影（Fundus fluorescein angiography，FFA）、病理及TUNEL法检测新生血管内皮细胞凋亡作对照。各实验组于光凝后14天先行FFA检查，然后给予不同处理因素。A组：光凝后14天玻璃体腔注射AdPEDF1μl；B组：光凝后14天玻璃体腔注射腺病毒载体注射液（AdNull）1μl；C组：光凝后14天球旁注射AdPEDF1μl；D组：光凝后14天球旁注射AdNull1μl。各实验组于给药后3、7、14及28天分别各随机抽取4只大鼠，FFA检查后处死，摘取眼球行组织病理学及TUNEL染色检查，观察CNV消退及新生血管内皮细胞凋亡情况。FFA记录光斑渗漏程度，光镜200倍视野下取连续切片的CNV最大中央厚度进行测量，应用SPSS11.5软件进行统计分析。结果：1．FFA检查结果：给药后7、14及28天，A组、C组给药后比给药前眼底视网膜光凝斑渗漏减轻；A组比B组、C组比D组CNV发生率降低（P＜0.01）。2．病理学检查：空白对照组光凝后14天，光镜下可见光凝区视网膜色素上皮（Retinal pigment epithelial，RPE）层和Bruch膜破裂，RPE细胞迁移增殖，CNV形成，纤维母细胞和胶原纤维增多。给药后3天，各实验组光镜下改变与空白对照组相似。给药后7天，光镜下A组与C组CNV数量减少；B组与D组显示CNV呈现显著的纤维血管增殖（Fibrovascular proliferation，FVP），其中可见大量新生血管，管腔内可见红细胞。给药后14天，光镜下A组与C组CNV数量明显减少，管腔缩小；B组与D组CNV保持稳定的FVP状态，可见大量新生血管。给药后28天，光镜下A组与C组CNV状态与给药后14天相似；B组与D组CNV中存在大量的纤维细胞、胶原纤维、迁移增殖的RPE细胞和新生血管。3．CNV中央厚度测量结果：3．1给药后A组比N组、C组比N组CNV中央厚度减小（P＜0.01）。其中A组内：N组比7、14、28天组CNV中央厚度大（P＜0.01）；3天组比7、14、28天组CNV中央厚度大（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）；7天组比14、28天组CNV中央厚度大（P＜0.01）。C组内：N组比7、14、28天组CNV中央厚度大（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）；3天组比14、28天组CNV中央厚度大（P＜0.01）；7天组比14、28天组CNV中央厚度大（P＜0.01）。3．2给药后不同时间点A组比B组、C组比D组CNV中央厚度均有所减小（P＜0.01）。3．3给药后3天A组比C组CNV中央厚度大（P＜0.05）；给药后14天及28天，A组比C组CNV中央厚度小（P＜0.01、P＜0.05）。4．TUNEL染色结果：A组与C组给药后3天，CNV内皮细胞及脉络膜固有血管内皮细胞均无TUNEL阳性细胞；给药后7天，CNV内皮细胞出现部分TUNEL阳性细胞（棕褐色颗粒），脉络膜固有血管内皮细胞无TUNEL阳性细胞；给药后14天，CNV内皮细胞出现大量TUNEL阳性细胞，脉络膜固有血管内皮细胞无TUNEL阳性细胞；给药后28天，检测结果与给药后14天相似。5．并发症：少数大鼠玻璃体腔注射后发生并发性白内障，余未见眼压升高、眼内感染及视网膜、眼周组织炎性反应等并发症。结论：1．AdPEDF对BN大鼠CNV具有抑制作用，其作用机制可能包括诱导新生血管内皮细胞凋亡。2．AdPEDF对BN大鼠CNV的抑制作用于治疗后7天起效，14天抑制作用最强并可持续至28天。3．球旁注射方式比玻璃体腔注射方式起效快，且简单易行，也可重复操作；玻璃体腔注射方式比球旁注射方式对新生血管的抑制作用强，但操作较为复杂，可重复性差并易引起并发性白内障等并发症。4．采用1μl浓度为1×1010pfu／ml的AdPEDF可以抑制CNV，且对视网膜及眼周组织无毒性反应

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