论文摘要
研究背景及目的皮肤老化分内源性老化和外源性老化,内源性因素引起的皮肤老化是不可避免的自然过程,其具体机制尚不清楚。在外源性因素中,紫外线的作用是最主要和最突出的因素,由于皮肤反复暴露于紫外线中造成的皮肤老化称为光老化（Photoaging）。光老化的皮肤发生结构和功能的特征性改变,临床上这些特征性改变包括:皱纹、皮肤松弛、粗糙萎缩、斑点状色素沉着、雀斑、毛细血管扩张、甚至癌变。成纤维细胞是真皮中最主要的细胞成分,紫外线（UV）照射导致成纤维细胞的过早衰老,胶原合成能力下降,基质金属蛋白酶（MMPs）表达升高,细胞外基质降解是皮肤光老化的最重要原因。紫外线依其波长分为短波紫外线UVC（200～280 nm）、中波紫外线UVB（280～320 nm）和长波紫外线UVA（320～400 nm）。99%的UVA到达地球表面,超过50%的UVA穿透表皮到达真皮层,作用于成纤维细胞。因此,UVA与人体皮肤关系密切,在皮肤光老化的发生日显重要,并受到各国公共卫生学者的关注。在皮肤光老化发生的机制方面,因UV照射产生氧自由基学说是目前国内外学者普遍承认的衰老理论之一,因而,近年来国内外学者针对UVA照射产生的氧自由基进行了大量的体内外抗氧化研究,但至今尚未找到确切的抗光老化方法。随着对光老化发生机制的研究深入,研究者发现细胞因子之间的调控对皮肤光老化起着很重要的作用,细胞因子在光老化中的作用越来越受到重视。但从细胞因子角度抗皮肤光老化的研究报道甚少。本研究旨在探讨不同剂量UVA照射体外培养的皮肽成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和TGF-β1表达情况;探讨加入TGF-β1对胶原合成的影响;TGF-β1对UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞MMP-1、MMP-3高表达有无抑制作用;对UVA照射导致的线粒体脱氧核糖核酸（mtDNA）缺失有无保护作用,以及TGF-β1对热休克蛋白70（HSP70）表达的影响,全面系统的探讨TGF-β1对UVA照射体外培养皮肤成纤维细胞光老化的保护作用,以及TGF-β1对UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞IGF-1、KGF,VEGF分泌的影响。研究方法:1.取年轻成人包皮成纤维细胞培养传代,用第5代细胞做实验对象,进行细胞分组。采用不同计量的UVA（5 J/cm2、10J/cm2、20J/cm2）照射,设立对照组（0 J/cm2.）,建立成纤维细胞光老化模型。培养24h后采用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测照射后细胞增殖活性,酶联免疫（ELISA）法测定UVA照射皮肤成纤维细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原和TGF-β1蛋白含量,半定量RT—PCR检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA、TGF-β1mRNA表达水平。2.在培养液中分别加入不同剂量TGF-β1,即小剂量（0.1ng/ml）、中剂量（1.0 ng/ml）、大剂量（10.0 ng/ml）,用UVA15J/cm2照射,采用酶联免疫（ELISA）法测定TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,HSP70表达变化;半定量RT—PCR检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA和MMP-1、MMP-3 mRNA、Smad3 mRNA表达变化,线粒体DNA（mtDNA）4977bp缺失情况。采用酶联免疫（ELISA）法测定TGF-β1对UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞上清液中IGF-1、KGF、VEGF含量的影响。研究结果:1.不同剂量的UVA（5 J/cm2、10J/cm2、20J/cm2）照射体外培养的皮肤成纤维细胞结果显示:随着UVA照射剂量增加,成纤维细胞OD值下降,与对照组比较,UVA 10 J/cm2、UVA 20 J/cm2照射组OD值明显下降,有非常显著性差异（P＜0.01）。Ⅰ型胶原含量和mRNA表达,随着UVA照射剂量增加而降低,呈剂量依赖关系。与对照组比较,UVA 10 J/cm2、UVA 20 J/cm2照射组降低明显（P＜0.05,P＜0.01）,UVA 20 J/cm2组抑制胶原合成作用更加明显,与对照组及其它两组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）。Ⅲ型胶原含量和mRNA表达,与对照组比较,UVA 20 J/cm2照射组明显降低,有非常显著性差异（P＜0.01）。TGF-β1蛋白含量和mRNA表达随着UVA照射剂量增加而降低,呈剂量依赖关系。与对照组比较,UVA 10 J/cm2、UVA 20 J/cm2照射组,TGF-β1蛋白含量和mRNA表达明显降低,有非常显著性差异（P＜0.01）。2.本实验通过UVA15 J/cm2照射不同剂量TGF-β1处理后的成纤维细胞,结果显示:随着TGF-β1剂量增加,大、中剂量组成纤维细胞OD值明显高于UVA照射组,有非常显著性差异（P＜0.01）。Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量随着TGF-β1剂量增加而增加,呈剂量依赖关系。大、中剂量组与UVA照射组比较,具有显著性差异（P＜0.01,P＜0.05）,大剂量组促进胶原合成作用更明显,有非常显著性差异（P＜0.01）。Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达,随着TGF-β1剂量增加而升高,呈剂量依赖关系。Ⅰ型胶原mRNA表达在大、中剂量组明显升高,与UVA照射组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）。Ⅲ型胶原mRNA表达,大剂量组与UVA照射组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）。不同剂量UVA照射后MMP-1、MMP-3mRNA表达与对照组比较,UVA 10J/cm2、UVA 20 J/cm2照射组,MMP-1、MMP-3mRNA表达明显升高,有显著性差异（P＜0.05,P＜0.01）,UVA 20 J/cm2组MMP-1、MMP-3mRNA表达升高更明显,有非常显著性差异（P＜0.01）。UVA照射前给予不同剂量TGF-β1处理,MMP-1、MMP-3 mRNA表达随着TGF-β1剂量增加表达降低,呈剂量依赖关系。MMP-1 mRNA表达,在大、中剂量组明显低于UVA照射组,有非常显著性差异（P＜0.01）;MMP-3 mRNA表达,大剂量组明显低于UVA照射组,有非常显著性差异（P＜0.01）,中剂量组与UVA照射组比较有显著性差异（P＜0.05）。不同剂量UVA照射后,各照射组Smad3表达降低于对照组,UVA 10 J/cm2、UVA 20 J/cm2照射组Smad3表达与对照组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）,5J/cm2照射剂量组与对照组比较,有显著性差异（P＜0.05）。UVA照射前给予不同剂量TGF-β1处理,随着TGF-β1剂量增加,Smad3 mRNA表达升高,呈剂量依赖关系。大、中剂量组Smad3mRNA升高较明显,与UVA照射组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）。小剂量组与UVA照射组比较,有显著性差异（P＜0.05）。3.培养皮肤成纤维细胞经UVA360nm照射,UVA累积剂量为UVA60J/cm2后发生mtDNA 4977 bp缺失,UVA90J/cm2时缺失明显（P＜0.01）。TGF-β1处理后,大剂量组mtDNA 4977 bp缺失减轻,与UVA照射组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）,中、小剂量组与UVA照射组比较无显著性差异（P＞0.05）。4.不同剂量UVA照射能呈现出剂量依赖的抑制HSP70表达,与对照组比较,UVA 10 J/cm2,UVA 20 J/cm2照射组,HSP70含量明显降低,有显著性差异（P＜0.05,P＜0.01）,UVA 20 J/cm2照射组抑制作用更明显,与对照组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）。照射前给予TGF-β1处理后,HSP70含量随着TGF-β1剂量增加而升高,呈剂量依赖关系。大剂量组HSP70含量明显高于UVA照射组,有非常显著性差异（P＜0.01）,中剂量组HSP70含量高于UVA照射组,有显著性差异（P＜0.05）。5.UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞导致IGF-1、KGF分泌下降,UVA10 J/cm2、UVA 20 J/cm2照射组明显下降,与对照组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）。VEGF分泌升高,UVA 20 J/cm2照射组与对照组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）。TGF-β1处理后,TGF-β1剂量依赖性地提高UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌三种因子的水平。大剂量组IGF-1、KGF、VEGF含量明显升高,与UVA照射组比较,有非常显著性差异(（P＜0.01）。结论:1.UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞,导致细胞衰老,增殖活性下降;对Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成有抑制作用,降低TGF-β1蛋白含量和mRNA表达水平,随UVA照射剂量增加而下降。提示UVA照射对胶原合成抑制作用与TGF-β1低表达有关,TGF-β1低表达和TGF-β/Smad信号传导通路受影响有关,在UVA照射导致的皮肤光老化发生过程中有着重要的作用。2.在UVA照射前加入TGF-β1,能提高体外培养皮肤成纤维细胞增殖活性,以剂量依赖方式促进UVA照射成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原的合成和mRNA表达。UVA照射成纤维细胞后,诱导MMP-1、MMP-3mRNA高表达,Smad3低表达;TGF-β1能降低MMP-1、MMP-3mRNA表达,增强Smad3表达,对UVA照射成纤维细胞光老化有保护作用。作用机制可能是TGF-β1促进成纤维细胞分裂增殖,TpR-Ⅱ表达增加,增强了TpR-Ⅱ对TGF-β的效应能力,促进成纤维细胞胶原合成,并通过TGF-β/Smad途径抑制MMP-1、MMP-3mRNA高表达。3.培养皮肤成纤维细胞经UVA360nm照射,UVA累积剂量为UVA60J/cm2后发生mtDNA 4977 bp缺失,UVA90J/cm2时缺失明显。给予一定剂量（10ng/ml）的TGF-β1后,可以使皮肤成纤维细胞mtDNA4977 bp缺失减轻。4.UVA照射抑制成纤维细胞对HSP70的表达,TGF-β1能使UVA照射成纤维细胞内HSP70表达升高,TGF-β1诱导UVA照射成纤维细胞内的HSP70高表达,对UVA照射成纤维细胞有保护作用。5.TGF-β1可提高UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌IGF-1、KGF、VEGF三种细胞因子的水平,有利于真皮内结构的恢复和重建,有潜在的临床应用价值。
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