论文摘要
在植物细胞的逆境信号转导途径中,Ca2+作为第二信使具有非常重要的作用。当植物细胞受到胁迫刺激时,会产生具有时空特征的Ca2+信号,通过各种Ca2+传感器蛋白识别和解码,激活下游的级联应答反应,导致许多逆境相关基因被诱导表达。类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL)家族是植物中特有的一类钙结合蛋白,CBL互作蛋白激酶(CIPK)家族是一类依赖Ca2+的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,具有保守的类SNF激酶结构域和NAF基序。CBL/CIPK信号系统被认为在植物逆境应答的信号转导中具有重要作用。水稻(Oryza sativa L.)是单子叶植物中研究最广泛的模式植物,也是世界上最重要的粮食作物,开展水稻CBL及CIKP基因的研究,不仅有助于了解植物逆境胁迫下CBL/CIPK信号网络的机制,而且对水稻及其它作物的抗逆性遗传改良也具有重要的指导作用。本研究根据拟南芥AtCIPK基因家族的氨基酸序列,利用电子克隆的方法,从水稻中分离了12条编码CIPK基因的全长cDNA序列,比较其基因组结构,发现12个基因的内含子、外显子结构差异较大,其中(?)(?)sCIPK3知OsCIPK24基因还存在两种不同的可变剪接方式;氨基酸序列分析表明12个OsCIPK蛋白的序列同源性较高,氨基酸一致性在41.2~78.5%之间,所有OsCIPKs蛋白的N端都具有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,C端都含有与CBL蛋白互作必需的NAF基序,对水稻幼苗中OsCIPKs基因的表达特征及多种逆境处理下的诱导表达进行了分析,发现高盐、低钾、ABA、汞胁迫、低温和白叶枯病菌等处理条件下,不同OsCIPK的表达特征明显不同,其中OsCIPK2.10、111和14基因等4个基因在上述6种逆境处理下的表达量都明显增加,推测这4个基因可能是逆境应答途径的上游调控因子,参与了多个抗逆信号转导途径。拟南芥AtCIPK24/SOS2已经被证明是耐盐SOS途径中的关键因子,本研究为了证实水稻OsCIPK24在逆境中的功能,将该基因两种可变剪接的ORF分别连接到pCAMBIA1304中,构建了两个过量表达的双元载体,利用农杆菌介导法转化水稻日本晴愈伤组织,经潮霉素筛选和PCR检测,获得了抗性转基因水稻幼苗。目前,OsCIPK24转基因植株的培育和功能检测正在进行之中。对前期利用农杆菌介导法获得的OsCBL8过量表达和抑制表达的转基因株系(T3代)进行目标基因的表达特征测定、农艺性状考察和高盐、干旱和低温等非生物逆境的耐逆性鉴定。半定量RT-PCR结果表明,转正义基因显著增强了植株中OsCBL8基因的表达量,而转反义基因则对内源OsCBL8基因的表达具有一定的抑制作用;在田间生长条件下,16个转基因株系的株高、分蘖数、有效穗数、穗长、百粒重等与对照无显著差异,但每穗实粒数和结实率显著或极显著低于对照,其中5个转基因株系的每穗实粒数和结实率极显著低于对照。获得一个耐盐性增强的转正义基因株系8F12,在150mM NaCl处理10d后,其幼苗根系K+/Na+比显著高于转反义基因株系和对照,茎叶K+/Na+比与转反义基因株系和对照无显著差异;筛选获得一个耐旱性显著增强的转反义基因株系8R14,在20%PEG6000模拟干旱处理2d后,其幼苗丙二醛和脯氨酸含量增幅均小于转正义基因株系和对照。在低温胁迫条件下,转正义基因株系、转反义基因株系、未转基因对照的生长状况,体内丙二醛含量和脯氨酸含量等无显著性差异。
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摘要ABSTRACT縮略表第一部分 文献综述第一章 植物逆境肋迫下的钙信号转导途径2+信号的产生'>1 逆境胁迫下Ca2+信号的产生2+信号'>1.1 Ca2+信号2+通道'>1.2 Ca2+通道2+泵和Ca2+/H+逆向运输器'>1.3 Ca2+泵和Ca2+/H+逆向运输器2+信号的解码'>2 Ca2+信号的解码2.1 钙调素(CaM)2.2 钙调素结合蛋白(CaMBP)2.3 类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL)2.4 钙依赖的蛋白激酶(CDPK)及CDPK相关的激酶(RCK)第二章 植物抗逆相关CBL与CIPK基因家族的研究1 拟南芥CBL与CIPK基因家族1.1 AtCBL基因家族1.2 AtCIPK基因家族2 水稻CBL与CIPK基因家族2.1 OsCBL基因家族2.2 OsCIPK基因家族3 其它植物的CBL与CIPK基因4 逆境胁迫下植物CBL-CIPK信号网络4.1 CBL与CIPK的特异性互作4.2 逆境胁迫下CBL-CIPK的功能4.2.1 盐胁迫应答途径4.2.2 低钾胁迫应答途径第二部分 研究报告第三章 12个水稻OsCIPK基因家族成员的克隆与表达分析摘要1 材料和方法1.1 植物材料生长1.2 菌种1.3 逆境处理1.4 总RNA的提取和cDNA第一链的合成1.5 OsCIPK基因的序列拼接与克隆1.6 OsCIPK基因的生物信息学分析1.7 水稻OsCIPK基因的RT-PCR分析1.8 水稻OsCIPK基因表达载体的构建1.9 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化1.10 转基因水稻阳性植株的PCR检测2 结果与分析2.1 OsCIPK基因的克隆和序列分析2.2 OsCIPK蛋白的氨基酸序列比较和进化树分析2.3 OsCIPK基因的表达特征2.4 OsCIPK24过量表达载体的构建和转基因研究3 讨论3.1 OsCIPK基因的进化3.2 OsCIPK的可变剪接3.3 OsCIPK基因诱导表达存在组织特异性3.4 OsCIPK与CBL/CIPK的网络节点3.5 抗冷和抗白叶枯病可能存在相对独立的信号途径3.6 不同的逆境诱导与OsCIPK基因结构的相关性3.7 OsCIPK24的转基因分析第四章 转OsCBL8基因水稻的抗逆性分析摘要1 材料与方法1.1 植物材料3代转基因植株农艺性状考察'>1.2 T3代转基因植株农艺性状考察1.3 TAIL-PCR法扩增转基因水稻中插入位点侧翼序列1.4 转基因水稻植株的OsCBL8基因表达检测1.5 转正反义OsCBL8水稻苗期的耐逆性分析1.5.1 脯氨酸含量的测定1.5.2 丙二醛含量的测定+、k+含量的测定'>1.5.3 Na+、k+含量的测定2 结果与分析2.1 转基因水稻农艺性状考察2.2 转基因水稻中插入区域侧翼序列的克隆与测序2.3 转正反义基因对植株内源OsCBL8基因表达的影响2.4 转基因植株的耐盐性分析2.4.1 转基因植株在盐胁迫下的生长2.4.2 NaCl处理对转基因植株钾、钠离子含量的影响2.5 转基因植株的抗旱性分析2.5.1 转基因植株在20%PEG6000处理下的生长2.5.2 PEG6000处理对转基因植株丙二醛(MDA)含量的影响2.5.3 PEG6000处理对转基因植株脯氨酸含量的影响2.6 转基因植株的耐冷性分析2.6.1 转基因植株在低温处理下的生长2.6.2 低温处理对转基因植株丙二醛含量的影响2.6.3 低温处理对转基因植株脯氨酸含量的影响3 讨论全文结论参考文献附录攻读博士期间发表或待发表的研究论文致谢
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标签:水稻论文; 基因克隆论文; 转基因论文; 胁迫论文;
水稻OsCIPK基因家族的克隆与转OsCBL8基因水稻的抗逆性分析
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