水稻OsCIPK基因家族的克隆与转OsCBL8基因水稻的抗逆性分析

水稻OsCIPK基因家族的克隆与转OsCBL8基因水稻的抗逆性分析

论文摘要

在植物细胞的逆境信号转导途径中,Ca2+作为第二信使具有非常重要的作用。当植物细胞受到胁迫刺激时,会产生具有时空特征的Ca2+信号,通过各种Ca2+传感器蛋白识别和解码,激活下游的级联应答反应,导致许多逆境相关基因被诱导表达。类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL)家族是植物中特有的一类钙结合蛋白,CBL互作蛋白激酶(CIPK)家族是一类依赖Ca2+的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,具有保守的类SNF激酶结构域和NAF基序。CBL/CIPK信号系统被认为在植物逆境应答的信号转导中具有重要作用。水稻(Oryza sativa L.)是单子叶植物中研究最广泛的模式植物,也是世界上最重要的粮食作物,开展水稻CBL及CIKP基因的研究,不仅有助于了解植物逆境胁迫下CBL/CIPK信号网络的机制,而且对水稻及其它作物的抗逆性遗传改良也具有重要的指导作用。本研究根据拟南芥AtCIPK基因家族的氨基酸序列,利用电子克隆的方法,从水稻中分离了12条编码CIPK基因的全长cDNA序列,比较其基因组结构,发现12个基因的内含子、外显子结构差异较大,其中(?)(?)sCIPK3知OsCIPK24基因还存在两种不同的可变剪接方式;氨基酸序列分析表明12个OsCIPK蛋白的序列同源性较高,氨基酸一致性在41.2~78.5%之间,所有OsCIPKs蛋白的N端都具有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,C端都含有与CBL蛋白互作必需的NAF基序,对水稻幼苗中OsCIPKs基因的表达特征及多种逆境处理下的诱导表达进行了分析,发现高盐、低钾、ABA、汞胁迫、低温和白叶枯病菌等处理条件下,不同OsCIPK的表达特征明显不同,其中OsCIPK2.10、111和14基因等4个基因在上述6种逆境处理下的表达量都明显增加,推测这4个基因可能是逆境应答途径的上游调控因子,参与了多个抗逆信号转导途径。拟南芥AtCIPK24/SOS2已经被证明是耐盐SOS途径中的关键因子,本研究为了证实水稻OsCIPK24在逆境中的功能,将该基因两种可变剪接的ORF分别连接到pCAMBIA1304中,构建了两个过量表达的双元载体,利用农杆菌介导法转化水稻日本晴愈伤组织,经潮霉素筛选和PCR检测,获得了抗性转基因水稻幼苗。目前,OsCIPK24转基因植株的培育和功能检测正在进行之中。对前期利用农杆菌介导法获得的OsCBL8过量表达和抑制表达的转基因株系(T3代)进行目标基因的表达特征测定、农艺性状考察和高盐、干旱和低温等非生物逆境的耐逆性鉴定。半定量RT-PCR结果表明,转正义基因显著增强了植株中OsCBL8基因的表达量,而转反义基因则对内源OsCBL8基因的表达具有一定的抑制作用;在田间生长条件下,16个转基因株系的株高、分蘖数、有效穗数、穗长、百粒重等与对照无显著差异,但每穗实粒数和结实率显著或极显著低于对照,其中5个转基因株系的每穗实粒数和结实率极显著低于对照。获得一个耐盐性增强的转正义基因株系8F12,在150mM NaCl处理10d后,其幼苗根系K+/Na+比显著高于转反义基因株系和对照,茎叶K+/Na+比与转反义基因株系和对照无显著差异;筛选获得一个耐旱性显著增强的转反义基因株系8R14,在20%PEG6000模拟干旱处理2d后,其幼苗丙二醛和脯氨酸含量增幅均小于转正义基因株系和对照。在低温胁迫条件下,转正义基因株系、转反义基因株系、未转基因对照的生长状况,体内丙二醛含量和脯氨酸含量等无显著性差异。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 縮略表
  • 第一部分 文献综述
  • 第一章 植物逆境肋迫下的钙信号转导途径
  • 2+信号的产生'>1 逆境胁迫下Ca2+信号的产生
  • 2+信号'>1.1 Ca2+信号
  • 2+通道'>1.2 Ca2+通道
  • 2+泵和Ca2+/H+逆向运输器'>1.3 Ca2+泵和Ca2+/H+逆向运输器
  • 2+信号的解码'>2 Ca2+信号的解码
  • 2.1 钙调素(CaM)
  • 2.2 钙调素结合蛋白(CaMBP)
  • 2.3 类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBL)
  • 2.4 钙依赖的蛋白激酶(CDPK)及CDPK相关的激酶(RCK)
  • 第二章 植物抗逆相关CBL与CIPK基因家族的研究
  • 1 拟南芥CBL与CIPK基因家族
  • 1.1 AtCBL基因家族
  • 1.2 AtCIPK基因家族
  • 2 水稻CBL与CIPK基因家族
  • 2.1 OsCBL基因家族
  • 2.2 OsCIPK基因家族
  • 3 其它植物的CBL与CIPK基因
  • 4 逆境胁迫下植物CBL-CIPK信号网络
  • 4.1 CBL与CIPK的特异性互作
  • 4.2 逆境胁迫下CBL-CIPK的功能
  • 4.2.1 盐胁迫应答途径
  • 4.2.2 低钾胁迫应答途径
  • 第二部分 研究报告
  • 第三章 12个水稻OsCIPK基因家族成员的克隆与表达分析
  • 摘要
  • 1 材料和方法
  • 1.1 植物材料生长
  • 1.2 菌种
  • 1.3 逆境处理
  • 1.4 总RNA的提取和cDNA第一链的合成
  • 1.5 OsCIPK基因的序列拼接与克隆
  • 1.6 OsCIPK基因的生物信息学分析
  • 1.7 水稻OsCIPK基因的RT-PCR分析
  • 1.8 水稻OsCIPK基因表达载体的构建
  • 1.9 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
  • 1.10 转基因水稻阳性植株的PCR检测
  • 2 结果与分析
  • 2.1 OsCIPK基因的克隆和序列分析
  • 2.2 OsCIPK蛋白的氨基酸序列比较和进化树分析
  • 2.3 OsCIPK基因的表达特征
  • 2.4 OsCIPK24过量表达载体的构建和转基因研究
  • 3 讨论
  • 3.1 OsCIPK基因的进化
  • 3.2 OsCIPK的可变剪接
  • 3.3 OsCIPK基因诱导表达存在组织特异性
  • 3.4 OsCIPK与CBL/CIPK的网络节点
  • 3.5 抗冷和抗白叶枯病可能存在相对独立的信号途径
  • 3.6 不同的逆境诱导与OsCIPK基因结构的相关性
  • 3.7 OsCIPK24的转基因分析
  • 第四章 转OsCBL8基因水稻的抗逆性分析
  • 摘要
  • 1 材料与方法
  • 1.1 植物材料
  • 3代转基因植株农艺性状考察'>1.2 T3代转基因植株农艺性状考察
  • 1.3 TAIL-PCR法扩增转基因水稻中插入位点侧翼序列
  • 1.4 转基因水稻植株的OsCBL8基因表达检测
  • 1.5 转正反义OsCBL8水稻苗期的耐逆性分析
  • 1.5.1 脯氨酸含量的测定
  • 1.5.2 丙二醛含量的测定
  • +、k+含量的测定'>1.5.3 Na+、k+含量的测定
  • 2 结果与分析
  • 2.1 转基因水稻农艺性状考察
  • 2.2 转基因水稻中插入区域侧翼序列的克隆与测序
  • 2.3 转正反义基因对植株内源OsCBL8基因表达的影响
  • 2.4 转基因植株的耐盐性分析
  • 2.4.1 转基因植株在盐胁迫下的生长
  • 2.4.2 NaCl处理对转基因植株钾、钠离子含量的影响
  • 2.5 转基因植株的抗旱性分析
  • 2.5.1 转基因植株在20%PEG6000处理下的生长
  • 2.5.2 PEG6000处理对转基因植株丙二醛(MDA)含量的影响
  • 2.5.3 PEG6000处理对转基因植株脯氨酸含量的影响
  • 2.6 转基因植株的耐冷性分析
  • 2.6.1 转基因植株在低温处理下的生长
  • 2.6.2 低温处理对转基因植株丙二醛含量的影响
  • 2.6.3 低温处理对转基因植株脯氨酸含量的影响
  • 3 讨论
  • 全文结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读博士期间发表或待发表的研究论文
  • 致谢
  • 相关论文文献

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