高效氯氰菊酯降解菌及其降解酶特性的研究

论文摘要

拟除虫菊酯类杀虫剂在环境中的残留和降解越来越成为关注的焦点,微生物降解是环境中拟除虫菊酯残留降解的有效途径。本研究对拟除虫菊酯降解菌进行了筛选和特性研究,以及对降解酶进行了粗步分离和特性研究。得到结果如下:从茶园、高粱地、青菜园等常施用农药的环境中采集了9份土壤样品,通过两种菌株筛选程序:富集筛选法和多平板筛选法,以高效氯氰菊酯为碳源筛选了110多株菌,最后获得18株能在100 mg/L高效氯氰菊酯平板上稳定生长的降解菌。分别用高效液相色谱对它们进行了降解率的测定,其中7株降解菌对高效氯氰菊酯的降解率在50%以上。降解率最高的菌株为E1,其降解率为80.07%。对其中三株降解率较高的菌株C1、E1、I3进行了形态特征和生理生化特征的初步鉴定,并进行了培养条件优化的研究。在前期研究中,本实验室已经分离到一株根瘤菌CY22-7菌株,这是第一次报道根瘤菌具有拟除虫菊酯类农药降解活性。因此,选取菌株CY22-7进一步研究。在LB培养基和高效氯氰菊酯培养基中培养达到稳定期的时间分别为36 h、72 h。为了验证菌株CY22-7降解能力的稳定性,将该菌株继代培养1代、5代、10代后发现,它们在LB培养基中呈现相似的生长曲线,在高效氯氰菊酯培养基中也呈现相似的生长曲线,并在含100 mg/L高效氯氰菊酯培养基中培养5 d后有相近似的高效氯氰菊酯农药降解率,表明该高效氯氰菊酯降解菌具有较好的降解能力和稳定性。对高效氯氰菊酯降解菌CY22-7进行了酶定域研究,用硫酸铵沉淀法提取胞外粗酶液,用细胞破碎和离心分离法提取胞内粗酶液。经降解反应测得胞外粗酶液对高效氯氰菊酯的降解活性较高,而胞内粗酶液对高效氯氰菊酯的降解活性较低,胞外粗酶液的降解活性达到胞内粗酶液降解活性的4.2倍。表明该高效氯氰菊酯降解菌的降解酶属于胞外酶。对降解菌CY22-7在高效氯氰菊酯农药培养基中培养1～6 d内产生的胞外酶粗提液的降解活性进行测定,结果表明第四天的降解酶活性最高,确定第四天为产降解酶的最佳时间。研究发现胞外酶粗提液降解高效氯氰菊酯反应的最适pH为7.0,在pH6～8时酶活稳定性较好;最适反应温度为42℃,温度低于30℃时酶活稳定性较高。不同的金属离子对高效氯氰菊酯降解酶的活性有不同的影响。Mg2+对粗酶液降解高效氯氰菊酯能力几乎没有影响。Mn2+和Cu2+对粗酶液降解高效氯氰菊酯有一定的抑制作用。而Zn2+、Fe2+能强烈抑制粗酶液对高效氯氰菊酯的降解作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 拟除虫菊酯类农药
• 1.1.1 拟除虫菊酯类农药简介
• 1.1.2 拟除虫菊酯类农药在环境中的残留和现状以及对非靶标生物的毒害
• 1.1.3 拟除虫菊酯类残留农药检测方法研究
• 1.1.3.1 农药残留分析的样品前处理技术
• 1.1.3.2 分光光度法
• 1.1.3.3 薄层色谱法（TLC）
• 1.1.3.4 气相色谱分析（GC）
• 1.1.3.5 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.1.3.6 联用技术
• 1.2 拟除虫菊酯类农药残留的微生物降解研究进展
• 1.2.1 降解拟除虫菊酯类农药残留的微生物种类
• 1.2.2 降解拟除虫菊酯类农药的酶和降解机制
• 1.2.2.1 降解酶的定域试验
• 1.2.2.2 降解酶的分离纯化
• 1.2.2.3 降解机理
• 1.2.2.4 降解酶基因克隆及其应用
• 1.3 在土壤修复中影响微生物降解拟除虫菊酯类农药残留的因素
• 1.3.1 温度和pH
• 1.3.2 金属离子对降解的影响
• 1.3.3 外加碳源、氮源
• 1.3.4 农药浓度
• 1.3.5 土壤有机物
• 1.4 拟除虫菊酯类农药降解研究存在的问题和本研究的意义
• 第二章 高效氯氰菊酯降解菌株的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 土样
• 2.1.1.2 培养基
• 2.1.1.3 试剂
• 2.1.1.4 仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 高效氯氰菊酯质量浓度标准曲线的制作
• 2.1.2.2 石油醚萃取水样中高效氯氰菊酯的添加回收率试验
• 2.1.2.3 采集土样
• 2.1.2.4 高效氯氰菊酯降解菌的初筛
• 2.1.2.5 菌株编号方式
• 2.1.2.6 高效氯氰菊酯降解菌的复筛
• 2.1.2.7 高效氯氰菊酯降解菌的降解率测定
• 2.1.2.8 高效氯氰菊酯降解菌的保存
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 高效氯氰菊酯质量浓度标准曲线
• 2.2.1.1 高效氯氰菊酯质量浓度与液相峰面积的标准曲线关系图
• 235值的标准曲线关系图'>2.2.1.2 高效氯氰菊酯质量浓度与 OD₂₃₅值的标准曲线关系图
• 2.2.1.3 高效液相色谱法和紫外分光光度计法检测高效氯氰菊酯的比较
• 2.2.2 石油醚萃取样品中高效氯氰菊酯的回收率
• 2.2.3 高效氯氰菊酯降解菌的筛选
• 2.2.3.1 高效氯氰菊酯降解菌的初筛
• 2.2.3.2 富集法和多平板法的比较
• 2.2.3.3 高效氯氰菊酯降解菌的复筛
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 高效氯氰菊酯降解菌的鉴定和培养条件研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 菌株
• 3.1.1.2 培养基
• 3.1.1.3 试剂
• 3.1.1.4 仪器
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 高效氯氰菊酯降解菌的形态特征鉴定
• 3.1.2.2 高效氯氰菊酯降解菌的生理生化特征鉴定
• 3.1.2.3 培养条件对高效氯氰菊酯降解菌生长情况的影响
• 3.1.2.4 培养条件对高效氯氰菊酯降解菌降解能力的影响
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 高效氯氰菊酯降解菌的鉴定
• 3.2.2 培养条件对高效氯氰菊酯降解菌生长情况的影响
• 3.2.2.1 营养成分对高效氯氰菊酯降解菌生长的影响
• 3.2.2.2 温度对降解菌生长的影响
• 3.2.2.3 pH 值对高效氯氰菊酯降解菌生长的影响
• 3.2.3 培养条件对高效氯氰菊酯降解菌降解能力的影响
• 3.2.3.1 温度对高效氯氰菊酯降解菌降解能力的影响
• 3.2.3.2 pH 值对高效氯氰菊酯降解菌降解能力的影响
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 降解菌 CY22-7 的降解特性和稳定性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 实验菌株
• 4.1.1.2 培养基
• 4.1.1.3 试剂
• 4.1.1.4 仪器
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 菌株 CY22-7 在高效氯氰菊酯农药培养基中的生长研究
• 4.1.2.2 菌株 CY22-7 在高效氯氰菊酯农药培养基中降解能力研究
• 4.1.2.3 高效氯氰菊酯降解菌 CY22-7 的稳定性研究
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 菌株CY22-7 在高效氯氰菊酯农药培养基中的生长
• 4.2.2 菌株CY22-7 在高效氯氰菊酯农药培养基中降解能力
• 4.2.3 CY22-7 菌株不同继代培养后在 LB 培养基中的生长曲线
• 4.2.4 CY22-7 菌株不同继代培养后在高效氯氰菊酯培养基中的生长曲线
• 4.2.5 不同继代培养物对高效氯氰菊酯的降解能力
• 4.3 小结与讨论
• 第五章 高效氯氰菊酯降解菌 CY22-7 的降解酶特性研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.1.1 实验菌株
• 5.1.1.2 培养基
• 5.1.1.3 试剂
• 5.1.1.4 溶液
• 5.1.1.5 药品
• 5.1.1.6 仪器
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 蛋白质含量测定方法
• 5.1.2.2 酶活力测定方法
• 5.1.2.3 降解酶定域试验
• 5.1.2.4 菌株 CY22-7 在高效氯氰菊酯无机盐培养基中的产酶情况研究
• 5.1.2.5 不同pH 值对酶活力的影响
• 5.1.2.6 粗酶液的pH 稳定性测定
• 5.1.2.7 不同温度对粗酶液活力的影响
• 5.1.2.8 粗酶液的热稳定性测定
• 5.1.2.9 不同金属离子对粗酶液活性的影响
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 牛血清白蛋白标准曲线
• 5.2.2 菌株CY22-7 降解酶的定域和产酶情况
• 5.2.3 不同pH 值对粗酶液活力的影响
• 5.2.4 粗酶液的pH 稳定性测定
• 5.2.5 不同温度对粗酶液活力的影响
• 5.2.6 粗酶液的热稳定性测定
• 5.2.7 不同金属离子对粗酶液活性的影响
• 5.3 小结与讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 建议和展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录