重组肠激酶包涵体的复性、纯化及其新型重组子的构建

论文摘要

肠激酶（enterokinase, EK）是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,可沿胰蛋白酶原序列中（Asp）4-Lys的羧基端切下,从而释放出活性胰蛋白酶。正是肠激酶在体内表现出的这种高度的酶切特异性使其成为当前基因工程领域融合蛋白表达后切割与纯化的重要工具之一。较之目前裂解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、轻胺等化学试剂,肠激酶具有非特异性切割少,反应条件宽泛,切割位点在全部识别序列之后,切出的目标产品首位氨基酸可完全忠实于天然蛋白等特点。近年来所做的尝试多是克隆与表达235个氨基酸的具有酶学活性的肠激酶轻链（EKL）。本论文的第一部分是对本实验室已构建好的工程菌pET39b-EKL/BL21（DE3）的蛋白表达、纯化进行研究。先确定了诱导条件:37℃下培养菌体,OD600为0.7时开始诱导,诱导6小时,IPTG终浓度为0.5mmol/L。随后对培养液上清中的目标蛋白进行亲和分离纯化,产量为每100毫升原发酵液中纯化后的目标蛋白肠激酶量为43.65μg,纯化收率8.34%。由于上清液中肠激酶收率不高,本文又对肠激酶包涵体进行变性复性、纯化研究。采用变性上柱、柱上复性方式进行镍离子亲和分离纯化,利用产物N段携带8个相连的组氨酸与金属螯合层析介质中的镍离子的亲和性,应用Ni-NTA金属螯和层析对样品包涵体进行纯化分离。实验结果表明,在变性条件下纯化的样品在柱上不经洗脱,直接用复性液洗涤,可以使肠激酶在得到提纯的同时实现复性。最后优化复性条件,提高收率。经测定包涵体复性后产量可达到470μg,纯化收率可达到20.3%。第二部分,本论文开创了另一种利用肠激酶蛋白的新思路——构建双质粒系统,让目的融合蛋白在体系中不需要再单独加入肠激酶蛋白就可进行融合蛋白的切割。并针对现在工业化生产中融合蛋白有以包涵体形式和可溶分泌表达形式两种情况,对双质粒系统进行了初步的构建。构建了一个复制子与大多商业化质粒不相同,拷贝数低,不影响目的蛋白大量表达的重组子——pSB3K3- EKL。将EKL基因插入到载体pSB3K3中,并就其表达出的肠激酶蛋白的活性影响条件进行了研究,确定了最佳缓冲液PH值为7.5;最佳反应温度为35℃;合理反应的反应时间为2h。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 融合蛋白的切割及工具酶
• 1.1.1 融合蛋白的应用
• 1.1.2 融合蛋白的切割
• 1.1.3 融合蛋白切割常用的工具酶
• 1.2 肠激酶简介
• 1.2.1 肠激酶的研究历史
• 1.2.2 肠激酶的结构特点
• 1.2.3 肠激酶的酶学特点及理化特征
• 1.2.4 肠激酶的基因工程研究进展
• 1.2.5 肠激酶的酶活测定
• 1.3 包涵体的研究进展
• 1.3.1 包涵体的形成机制
• 1.3.2 蛋白质的体内折叠机制
• 1.3.3 包涵体的体外折叠机制
• 1.3.4 包涵体蛋白复性策略
• 1.4 亲和层析
• 1.4.1 亲和层析技术的产生与发展
• 1.4.2 亲和吸附介质
• 1.4.3 亲和纯化的操作方式
• 1.4.4 固定化金属离子亲和层析
• 1.5 相容质粒的共表达
• 1.5.1 共表达的应用
• 1.5.2 共表达的策略
• 1.6 本文的主要研究内容
• 第二章 肠激酶蛋白包涵体的复性与纯化
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试验试剂
• 2.1.3 主要试验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 肠激酶蛋白的初步表达
• 2.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达结果
• 2.2.3 上清液中肠激酶亲和层析分离
• 2.2.4 包涵体中目的蛋白的复性与纯化
• 2.2.5 融合蛋白的定量估算
• 2.2.6 纯化后目标蛋白收率的计算
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 工程菌生长曲线测定
• 2.3.2 诱导表达产物的SDS-PAGE 鉴定
• 2.3.3 上清液中肠激酶亲和层析分离
• 2.3.4 包涵体中目的蛋白的复性与纯化
• 2.3.5 目标蛋白纯化后产量及收率
• L构建'>第三章 重组质粒pSB3K3-EK_L构建
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种和载体
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌种活化及质粒提取
• 3.2.2 感受态细胞的制备
• L构建策略'>3.2.3 重组质粒pSB3K3-EK_L构建策略
• 3.2.4 肠激酶包涵体蛋白的表达变性复性
• 3.2.5 肠激酶的活性测定
• 3.3 结果与讨论
• LPCR 扩增产物及酶切的电泳鉴定'>3.3.1 EK_LPCR 扩增产物及酶切的电泳鉴定
• 3.3.2 pSB3K3-8p 酶切鉴定及与PCR 产物双酶切切胶回收电泳鉴定
• 3.3.3 重组子的酶切鉴定
• 3.3.4 重组子的基因测序
• 3.3.5 不同条件对肠激酶蛋白活性的影响
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢