RUNX2在乳腺癌细胞EMT及转移中作用与分子机制研究

论文摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,每年全球约120万妇女患乳腺癌,占恶性肿瘤的7-10%,转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因,而上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是转移的早期关键步骤,研究探讨乳腺癌转移及EMT的分子机制,对于准确判断乳腺癌患者的预后及指导治疗具有重要的临床意义。方法:1.运用免疫组化技术对493例乳腺癌患者组织切片中RUNX2表达情况进行了检测,且进一步探讨了 RUNX2的表达与乳腺癌患者临床-病理参数与预后的相关性。2.通过利用TGF-β1诱导乳腺癌细胞,构建EMT模型,选择最佳的刺激浓度和刺激时间;通过光学显微镜观察对照组及TGF-β1诱导的EMT模型中细胞形态学的改变;并通过Western Blot检测EMT模型中Vimentin、E-cadherin、Fibronectin、Snail、Slug及RUNX2的表达的变化。RNA干扰及转染技术沉默RUNX2的表达:通过光学显微镜观察RUNX2表达下调后细胞形态学的改变;通过 Western Blot 及 RT-PCR 检测 Vimentin、E-cadherin、Fibronectin、Snail及Slug等EMT相关指标表达的改变;通过transwell侵袭试验检测RUNX2表达的下调对乳腺癌细胞侵袭性,以及对MMP-9、MMP-13及VEGF等指标表达的影响。3.通过Western Blot及免疫荧光等技术研究TGF-β1刺激过程中Smad2/3、Smad1/5/8,PI3K/AKT和MAPK/ERK通路对RUNX2表达的调控;应用免疫共沉淀法研究了 TGF-β1刺激后RUNX2/Smad复合物的形成情况及RUNX2磷酸化水平的改变;通过Western Blot研究TGF-β1刺激后PI3K/AKT及MAPK/ERK等旁路信号的激活情况;应用PI3K抑制剂LY294002及MAPK抑制剂PD98059抑制通路活性,研究这两条旁路对EMT的辅助调节作用,特别是对RUNX2磷酸化及转位入核的调控作用;并通过光学显微镜研究这两种抑制剂对EMT细胞形态学的影响。4.研究ER通路对RUNX2及Slug表达的调控作用:通过光学显微镜观察细胞形态学的改变;通过 Western Blot 及 RT-PCR 检测 Vimentin、E-cadherin、Fibronectin、Snail及Slug等EMT相关指标表达的改变;通过光学显微镜、Western Blot、RT-PCR及transwell侵袭试验等试验手段研究RUNX2及ER通路下游转录因子Slug在乳腺癌细胞EMT中的关键作用。结果:1.RUNX2蛋白高表达与雌激素受体α（estrogen receptor,ERα）（p=0.014）及人类表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）（p=0.02）的表达状态、组织学分级（p=0.046）、肿瘤分期（p=0.0004）以及发生远处转移（p<0.0001）密切相关,而与其他临床病理指标,如患者年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结状态等无明显相关性。进一步分析了 463例无远处转移乳腺癌组织标本中RUNX2的表达与患者预后指标之间的相关性。结果显示,RUNX2的表达与患者无病生存率（p=0.01）及总生存率（p=0.003）呈明显的负相关性,且这种相关性与ERα表达状态相关。其中,ERα阴性的患者中RUNX2的表达与其无病生存率及总生存率表现为负相关性,而在ERα阳性表达的患者中未见明显相关性。2.TGF-β 1诱导MCF-7乳腺癌细胞形态变成长梭形,细胞间粘附消失,并伴随着一系列EMT相关指标的改变,如上皮指标E钙粘素（E-cadherin）表达下降,间质指标如纤粘连蛋白（Fibronectin,FN）、波形蛋白（Vimentin）和转录因子Snail蛋白表达增加。但是RUNX2的抑制会阻断TGF-βl对乳腺癌MCF-7细胞系EMT的诱导作用。通过Western Blot及RT-PCR检测EMT相关指标的变化同样支持以上结论。此外,siRNA沉默RUNX2的表达,细胞的侵袭性会显著降低,基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）、MMP13 及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等侵袭相关蛋白的mRNA转录也明显下调。3.免疫共沉淀实验证实,TGF-β1激活相应通路后,Smad2可与RUNX2结合为复合物,该过程伴有Smad2及RUNX2的磷酸化。除了 Smad参与RUNX2调节外,TGF-β通路激活后可同时激活旁路信号对RUNX2及EMT过程进行调控。研究发现,TGF-β可激活PI3K/AKT及MAPK等旁路信号,而通过特异性通路抑制剂抑制PI3K/AKT及MAPK通路后,RUNX2的磷酸化水平减少,且EMT相关指标如E-cadherin表达上调,Vimentin、Fibronectin、Snail及Slug表达均下调。通路抑制试验结果显示,MAPK通路对于RUNX2的入核起主要的调控作用,抑制MAPK通路的活性RUNX2则无法进入细胞核。然而PI3K/AKT通路对Runx2的入核无明显调控作用。4.沉默Slug表达之后,TGF-β1所诱导的EMT过程明显受到抑制,同时,ERα信号通路可抑制RUNX2及下游转录因子Slug的表达,Slug作为ERα及RUNX2下游的共同转录因子,是连接ERα、RUNX2及EMT的桥梁。Slug同时接受ERα及RUNX2的抑制或刺激性信号,从而对乳腺癌细胞的EMT过程进行精确调节。此外,ER信号还能够调节RUNX2的表达,直接拮抗RUNX2的促EMT作用。结论:1.RUNX2是乳腺癌患者关键的预后指标,其高表达预示患者预后不良。并且RUNX2对EMT的调节通路可能受ER信号的负调节作用。2.RUNX2在乳腺癌MCF-7细胞EMT及细胞侵袭过程中发挥着重要的作用。3.TGF-βl是通过磷酸化修饰活化RUNX2,促进RUNX2由细胞质转位入细胞核,行使核转录调节作用,进而调节EMT过程。PI3K/AKT及MAPK通路在调节RUNX2磷酸化水平及EMT过程中均起着重要的辅助调节作用,而MAPK途径在调节RUNX2转位入核的过程起主导作用。4.Slug在EMT中起十分关键的作用,在缺乏Slug表达的情况下,EMT受到明显抑制。ER信号通过抑制RUNX2及Slug的表达,对EMT过程呈负调节作用。ER信号通路与RUNX2组成了 EMT的共调节通路,二者主要是通过调控下游转录因子Slug从而实现了对EMT的精确调控。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、RUNX2在临床标本中的表达与意义
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 试验方法及步骤
• 1.2 结果
• 1.2.1 RUNX2在乳腺浸润性癌组织中的表达
• 1.2.2 RUNX2表达与乳腺浸润性癌临床病例参数之间的相关性
• 1.2.3 RUNX2与乳腺癌临床预后之间的相关性
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、EMT模型的建立及RUNX2在在EMT中的关键作用
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法及步骤
• 2.2 结果
• 2.2.1 TGF-β1诱导乳腺癌MCF-7细胞系发生EMT
• 2.2.2 RUNX2沉默对于EMT关键指标的影响
• 2.2.3 RUNX2的表达对乳腺癌MCF-7侵袭能力的影响
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、Smad及非Smad依赖性通路对RUNX2的调控作用
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法及步骤
• 3.2 结果
• 3.2.1 在TGF-β1激活的通路中,对RUNX2入核的影响
• 3.2.2 Smad通路对RUNX2的调控作用
• 3.2.3 PI3K/Akt及MAPK等旁路信号对EMT的调控作用
• 3.2.4 PI3K/Akt及MAPK等旁路信号对RUNX2的调控作用
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 四、ER信号与RUNX2对EMT的共调控作用
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法及步骤
• 4.2 结果
• 4.2.1 Slug是RUNX2下游重要的靶分子
• 4.2.2 ER拮抗RUNX2介导的EMT过程
• 4.2.3 Slug在RUNX2诱导的EMT中起重要作用
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 全文结论
• 论文创新点
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 EMT与肿瘤关系的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢