大豆胞囊线虫环境适应性的研究

论文摘要

大豆胞囊线虫病是一种为害大豆生产的重要病害，其病原物大豆胞囊线虫（Heterodera glycines，Ichinohe，1952；Soybean Cyst Nematode SCN）是一类进化程度较高的植物寄生线虫，由于其生活史循环中具有“胞囊期”这个特殊的休眠阶段，使其对不良环境条件具有较高的抗性，特别能够适应冬季的低温。本文针对在大豆生产中SCN常遇的逆境因子，研究了不同胁迫条件对SCN的影响，以期从生理生化角度和分子角度揭示SCN抗逆境胁迫的机制，主要研究内容如下：1．通过测定大量和微量元素化合物在寄主体外对大豆胞囊线虫二龄幼虫（J2）存活、卵孵化的影响，明确了不同化合物对大豆胞囊线虫的抑制作用。其中KH2PO4、（NH4）2HPO4和FeCl3·6H2O分别为大量元素化合物和微量元素化合物中对大豆胞囊线虫J2存活抑制作用较强的化合物。尤其是盆栽条件下，FeCl3·6H2O对大豆胞囊线虫繁殖有很强的抑制作用，（NH4）2HPO4和FeCl3·6H2O对大豆根的生长有明显的促进作用。在对J2作用的LC50浓度下，绝大多数化合物对胞囊卵孵化具有很强的抑制作用。2．通过测定大豆田常用的8种除草剂对SCN在寄主体外存活和孵化的影响。得到了SCN敏感的除草剂为乙草胺和2,4-滴丁酯+异丙草胺，在田间喷施浓度下二者分别对SCNJ2的存活和卵孵化的抑制作用最强。进而测定了温室和田间乙草胺和2,4-滴丁酯+异丙草胺对SCN在大豆上繁殖的影响，证实了这两种除草剂对SCN的繁殖具有较强的抑制作用。且乙草胺和2,4-滴丁酯+异丙草胺对大豆生长均无不良影响。3．通过测定不同pH值条件下SCN J2的死亡率，明确了SCN J2对酸性和碱性环境均有很强的适应性。测定了温度、pH值、光照和土壤含水量对休眠SCN的影响，结果证明pH 9．0 KOH、pH 5．0H2SO4和pH 6．0 H2MoO4均能促进SCN卵的孵化。此外，SCN J2对低温和高温逆境均有一定程度的抗性，尤其是对低温有较强的适应能力，并且低温和高温锻炼能够显著地增强SCN J2对低温和高温胁迫的抗性。通过分析海藻糖与SCN耐低温、高温的关系，得出SCN体内海藻糖含量与其对低温的适应性显著相关，而与其耐热性无显著关系。在一定的范围内，温度的升高有助于SCN休眠的解除，且能够提高非休眠卵的孵化率；增加光照时间有助于SCN卵的孵化和打破休眠；在寄主体外，15％的土壤含水量最适合SCN卵孵化。4．首次对不同方法提取大豆胞囊线虫不同虫态基因组DNA进行了比较，结果表明，不同虫态的样品中以白色雌成虫制备的DNA质量较好，而以不同方法和不同虫态提取的DNA为模板进行扩增，其质量均不影响已知片段的扩增结果。采用基因组步移技术，从SCN全基因组中得到了SCN热激蛋白70（Hsp70）基因的DNA序列，长度为2841bp；再通过RT-PCR得到了长度为1950bp的SCN Hsp70基因（Hg-Hsp-70）编码区，其GeneBank登录号为FJ816100。根据已知序列设计引物，克隆到SCN热激蛋白90（Hsp90）的DNA序列，长3003bp；通过RT-PCR得到了长度为2163bp的SCN Hsp90基因（Hg-Hsp-90）全长编码区，二者的GeneBank登录号分别为FJ985783和FJ985784。5．利用pEASY-E1成功构建了SCN Hsp70和Hsp90的原核表达载体Hg70pEASY-E1和Hg90pEASY-E1并在大肠杆菌Transetta（DE3）中成功地进行了表达。以pET-30为载体，实现了SCN Hsp70的非融合表达；经Western blot检测，验证了原核表达获得的Hg-Hsp-70和Hg-Hsp-90蛋白确实属于Hsp蛋白家族（Hsps）。6．以actin基因作为内参照基因，采用半定量RT-PCR技术，对温度和化学胁迫前后，SCN体内Hsp70和Hsp90基因表达的差异进行了检测。结果表明，SCN Hsp70基因的过表达确为SCN耐胁迫的重要机制之一。SCN受到温度和化学胁迫后，体内的Hg-Hsp-70和Hg-Hsp-90基因的表达量均有不同程度的增加，但经高温胁迫后基因表达量的上升幅度高于低温胁迫后表达量的上升幅度；在绝大部分胁迫处理中，SCNHg-Hsp-90基因表达量的增幅都低于Hg-Hsp-7D基因。利用显微镜对虫体进行观察发现，SCN受到化学胁迫后，体壁发生不同程度的缢缩现象，有的胁迫处理后虫体头部口针明显突出体外。酶标仪对海藻糖和海藻糖酶测定的结果显示，化学胁迫使SCN体内海藻糖含量上升，且随着胁迫时间的增加，海藻糖含量呈先上升后下降的趋势；海藻糖酶活性随着胁迫时间的增加而升高。说明在化学胁迫下，SCN自身通过海藻糖的合成和分解对机体进行调控，以适应或抵抗逆境胁迫。7．通过测定不同休眠阶段SCN体内生理生化物质的含量，明确了休眠期SCN体内物质变化的动态规律。即SCN休眠期间的糖醇积累型属海藻糖积累型，同时总糖、糖原和可溶性蛋白也参与休眠SCN体内物质代谢，为SCN休眠期消耗提供了能量，甘油与SCN休眠及抗寒能力密切相关。证实了SCN休眠程度越深，体内氨基酸总含量越多，休眠程度浅或处于活动状态时，氨基酸含量较少。游离亮氨酸、组氨酸和异亮氨酸与休眠过程中的生命活动有一定的关系，且水解苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸在SCN休眠过程中与氨基酸的代谢有关。SDS-PAGE电泳结果显示，在各个休眠阶段SCN全蛋白种类无明显变化。海藻糖酶、糖原磷酸化酶（Gpase）、山梨醇脱氢酶（NAD-SDH）、磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）和果糖1-6-二磷酸羧醛酶（FBP）均与SCN休眠密切相关，进入休眠SCN体内海藻糖酶活性迅速升高，Gpase活性也显著升高，有利于海藻糖所需的碳源的供给，而PFK、PK、FBP和NAD-SDH四种酶活性均显著降低，休眠解除后活性回升。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 大豆胞囊线虫的环境适应性及热激蛋白的研究进展
• 1.1 大豆胞囊线虫的环境适应性
• 1.1.1 土壤温度
• 1.1.2 土壤湿度（含水量）
• 1.1.3 土壤类型（矿质成分）
• 1.1.4 pH值（酸碱度）
• 1.1.5 离子、化合物及渗透压
• 1.1.6 植物根系分泌物
• 1.1.7 农用化学品
• 1.1.8 线虫对逆境的适应性
• 1.2 热激蛋白
• 1.2.1 热激蛋白的发现及研究历史
• 1.2.2 热激蛋白的分类及特点
• 1.2.3 热激蛋白的生物学功能
• 1.2.4 热激蛋白的表达调控
• 1.2.5 植物寄生线虫热激蛋白
• 1.2.6 热激蛋白与环境适应性
• 1.2.7 热激蛋白与进化
• 1.3 展望
• 第二章 化合物对大豆胞囊线虫存活、孵化和繁殖的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试药品
• 2.1.2 大豆胞囊线虫的培养
• 2.1.3 化合物对SCN J2存活的影响
• 2.1.4 化合物对SCN卵孵化的影响
• 2.1.5 化合物对大豆种子的影响
• 2.1.6 温室盆栽试验
• 2.1.7 田间试验
• 2.1.8 数据分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同化合物对SCN J2存活的影响
• 2.2.2 不同化合物对SCN卵孵化的影响
• 2.2.3 SCN J2敏感化合物对大豆种子萌发和根生长的影响
• 2.2.4 温室盆栽条件下SCN J2敏感化合物对SCN繁殖的影响
• 2.2.5 SCN J2敏感化合物对大田SCN繁殖的影响
• 2.2.6 SCN J2敏感化合物对大豆地下部分生长的影响
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 除草剂对大豆胞囊线虫存活、孵化和繁殖的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试除草剂
• 3.1.2 大豆胞囊线虫的培养
• 3.1.3 除草剂对SCN J2存活的影响
• 3.1.4 除草剂对SCN卵孵化的影响
• 3.1.5 除草剂对大豆种子的处理
• 3.1.6 温室盆栽试验及大田试验
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 除草剂对SCN J2存活的影响
• 3.2.2 除草剂对SCN卵孵化试验
• 3.2.3 除草剂对大豆种子萌发的影响
• 3.2.4 乙草胺和2,4-滴丁酯+异丙草胺对温室和田间SCN繁殖的影响
• 3.2.5 乙草胺和2,4-滴丁酯+异丙草胺对苗期大豆根系生长的影响
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 相关逆境因子对大豆胞囊线虫的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试药品
• 4.1.2 溶液配制
• 4.1.3 仪器设备
• 4.1.4 大豆胞囊线虫的培养
• 4.1.5 SCN J2对不同pH值的适应性
• 4.1.6 不同pH值条件对SCN休眠卵孵化的影响
• 4.1.7 SCN对逆境温度的适应性
• 4.1.8 J2体内海藻糖变化与SCN耐冷耐热性关系的分析
• 4.1.9 温度对SCN卵孵化的影响
• 4.1.10 光照对SCN孵化的影响
• 4.1.11 土壤含水量对SCN孵化的影响
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 SCN J2对不同pH值的适应性
• 4.2.2 不同pH值条件对SCN休眠卵孵化的影响
• 4.2.3 SCN对逆境温度的适应性
• 4.2.4 海藻糖与SCN耐高低温关系的分析
• 4.2.5 温度对SCN卵孵化的影响
• 4.2.6 光照对SCN孵化的影响
• 4.2.7 土壤含水量对SCN孵化的影响
• 4.3 结论与讨论
• 4.3.1 结论
• 4.3.2 讨论
• 第五章 大豆胞囊线虫热激蛋白基因（Hsp70,Hsp90）的克隆
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 培养基配制
• 5.1.4 常用溶液的配制
• 5.1.5 基因组DNA的提取
• 5.1.6 ITS rDNA片段的扩增
• 5.1.7 SCN Hsp70基因（Hg-Hsp-70）的扩增
• 5.1.8 SCN Hsp90基因（Hg-Hsp-90）的扩增
• 5.1.9 DNA片段的回收:
• 5.1.10 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备:
• 5.1.11 回收片段的连接和转化
• 5.1.12 重组质粒的鉴定
• 5.1.13 基因序列的测定与分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 不同方法提取SCN基因组总DNA比较
• 5.2.2 SCN Hsp70基因（Hg-Hsp-7D）的克隆
• 5.2.3 Hg-Hsp-70基因序列分析
• 5.2.4 SCN Hsp90基因（Hg-Hsp-90）的克隆
• 5.2.5 Hg-Hsp-90基因序列分析
• 5.3 结论与讨论
• 5.3.1 结论
• 5.3.2 讨论
• 第六章 大豆胞囊线虫热激蛋白（Hsp70,Hsp90）的原核表达
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 仪器设备
• 6.1.2 菌种及质粒
• 6.1.3 试剂及试剂盒
• 6.1.4 常用溶液的配制
• 6.1.5 SCN Hsp70、Hsp90原核表达载体的构建
• 6.1.6 测序及序列分析
• 6.1.7 SCN Hsp70和Hsp90的表达
• 6.1.8 表达产物的SDS-PAGE电泳检测
• 6.1.9 表达产物的Western Blot分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 载体pEASY-Hsp70构建结果
• 6.2.2 载体pEASY-Hsp90构建结果
• 6.2.3 载体pET30-Hsp70构建结果
• 6.2.4 pEASY-Hsp70、pET30-Hsp70、pEASY-Hsp90转化受体细菌转化子的筛选
• 6.2.5 Hsp70和Hsp90的表达
• 6.2.6 IPTG浓度对Hsp70、Hsp90融合蛋白表达量的影响
• 6.2.7 诱导时间对Hsp70、Hsp90融合蛋白表达量的影响
• 6.2.8 表达产物的Western blot分析
• 6.3 结论与讨论
• 6.3.1 结论
• 6.3.2 讨论
• 第七章 热激蛋白（Hsp）及海藻糖与大豆胞囊线虫耐胁迫关系的分析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 供试药品与试剂
• 7.1.2 大豆胞囊线虫（SCN）的繁殖
• 7.1.3 SCN的处理
• 7.1.4 线虫的观察方法
• 7.1.5 RNA的提取
• 7.1.6 cDNA的合成
• 7.1.7 引物设计
• 7.1.8 RT-PCR
• 7.1.9 PCR产物的半定量分析
• 7.1.10 海藻糖的提取和测定
• 7.1.11 海藻糖酶的提取和测定
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 逆境胁迫后SCN J2虫态的变化
• 7.2.2 逆境胁迫对Hg-Hsp-70和Hg-Hsp-70基因表达的影响
• 7.2.3 化学胁迫对SCN体内海藻糖含量和海藻糖酶活性的影响
• 7.3 结论与讨论
• 7.3.1 结论
• 7.3.2 讨论
• 第八章 休眠期大豆胞囊线虫体内生理生化代谢特征
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 供试线虫
• 8.1.2 糖类测定
• 8.1.3 甘油测定
• 8.1.4 可溶性蛋白质含量测定
• 8.1.5 氨基酸测定
• 8.1.6 全蛋白分析
• 8.1.7 同工酶电泳
• 8.1.8 酶活性测定
• 8.1.9 主要实验仪器
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 SCN休眠期体内糖类物质含量的变化
• 8.2.2 SCN休眠期体内甘油含量的变化
• 8.2.3 SCN休眠期体内可溶性蛋白质含量的变化
• 8.2.4 休眠期各阶段SCN体内各类物质含量
• 8.2.5 SCN休眠期体内氨基酸含量的变化
• 8.2.6 SCN休眠前后全蛋白质SDS-PAGE电泳分析
• 8.2.7 SCN休眠前后同工酶电泳分析
• 8.2.8 SCN休眠期体内海藻糖酶、PFK、PK、FBP、Gpase和NAD-SDH活性变化
• 8.3 结论与讨论
• 8.3.1 结论
• 8.3.2 讨论
• 第九章 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文情况