蓝舌病病毒VP3、5、7蛋白及小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其抗原性分析

论文摘要

蓝舌病（BT）是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒（BTV）引起的,经媒介昆虫（如库蠓、伊蚊等）传播的反刍动物一种烈性传染病。目前,蓝舌病已被国际动物卫生组织（OIE）列为法定报告的多种动物共患病之一,该病严重危害我国畜牧业和国际动物及其产品进出贸易的发展。在蓝舌病病毒编码的蛋白中,VP3蛋白是病毒颗粒的主要核心蛋白,含有群特异性抗原决定簇。VP5构成病毒外壳蛋白,为型特异性抗原,VP5是唯一的糖基化蛋白,糖基化作用与病毒的致病作用有关。VP7是BTV内衣壳的一个主要的结构蛋白,含有群特异抗原决定簇,能刺激机体产生强的群特异性反应。因此,蓝舌病病毒VP3、VP5和VP7蛋白已成为研究热点。本研究在克隆并鉴定蓝舌病病毒VP3、5、7基因的基础上,进行原核表达,并制备了多克隆抗体,表达的蛋白为诊断试剂以及新型疫苗VLPs的研制奠定了基础。小反刍兽疫（PPR）是由小反刍兽疫病毒（PPRV）引起的危害山羊、绵羊等小反刍动物的重大疫病,为世界动物卫生组织发布的A类烈性传染病之一。近年来,PPR在我国周边国家和地区及我国西藏自治区的肆虐对我国的养羊业构成严重的威胁。PPRV基因组主要编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白,H基因编码蛋白作为病毒和宿主细胞膜结合过程中的受体,调节病毒吸附并侵入宿主细胞,是病毒的主要抗原成份,也是引起宿主细胞发生病变的主要蛋白。因此,对H蛋白的研究极其重要。本研究通过构建pET-32a-H重组质粒,成功的实现了H蛋白的原核表达,为小反刍兽疫疫苗的研制及标准检测（血清学检测）用抗原的研究奠定了基础。1蓝舌病病毒VP3,5,7蛋白的原核表达及表达产物的免疫原性鉴定根据已发表BTV-12的VP3,VP5和VP7基因序列,设计并合成4对引物。利用RT-PCR方法扩增BTV-12型毒株的VP3,VP5和VP7基因片段。将扩增片段分别克隆至pET-30a和pMAL-c2x载体中,构建重组质粒载体。经核苷酸序列测定后正确的阳性克隆质粒分别在BL21（DE3）和TB1感受态细胞中经IPTG诱导表达。筛选到高表达载体pET-30a-VP3-1、pET:30a-VP3-2.pMAL-VP5和pMAL-VP7,镍琼脂糖凝胶亲和层析分离pET-30a-VP3-1和pET:30a-VP3-2表达的带His标签的重组VP3-1和VP3-2蛋白。按pMAL融合蛋白纯化系统说明书用直链淀粉树脂对融合表达的VP5和VP7蛋白进行纯化。SDS-PAGE和Western blot试验表明,表达蛋白均为融合蛋白,分子量均与预期大小相符。间接ELISA实验结果表明VP5具有较好的免疫原性。2小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及表达产物的免疫原性鉴定根据Genbank公布的PPRV Nigeria/75/1疫苗株的碱基序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR方法扩增PPRV Nigeria/75/1型毒株的H基因片段。将扩增片段克隆至pET-32a载体中,构建H基因载体。经核苷酸序列测定后正确的阳性克隆质粒在BL21（DE3）感受态细胞中经IPTG诱导表达。筛选到高表达载体pET-32a-H,镍琼脂糖凝胶亲和层析分离pET-32a-H表达的带His标签的重组H蛋白。SDS-PAGE和Western blot试验表明,表达蛋白为融合蛋白,分子量为87ku, H蛋白能与PPRV阳性血清发生特异性反应,显示其具有良好的免疫原性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及縮略语说明
• 第一篇 文献综述
• 第一章 蓝舌病研究进展
• 1 蓝舌病
• 1.1 蓝舌病的历史与分布
• 1.2 蓝舌病的流行病学特征
• 1.3 蓝舌病病原特性
• 1.4 蓝舌病病毒的致病机理
• 1.5 蓝舌病病毒疫苗的研究进展
• 2 BTV检测方法研究进展
• 2.1 血清学检测方法
• 2.2 分子生物学检测方法
• 3 问题及展望
• 第二章 小反刍兽疫研究进展
• 1 小反刍兽疫
• 1.1 小反刍兽疫（PPR）概述
• 1.2 PPRV的生物学特性
• 1.3 PPRV病原学特征
• 1.4 PPRV的蛋白结构及功能
• 2 PPRV检测方法研究进展
• 2.1 血清学检测方法
• 2.2 分子生物学检测方法
• 3 问题和展望
• 第二篇 试验部分
• 第三章 蓝舌病病毒VP 3、5、7蛋白的原核表达及表达产物的免疫原性鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 BTV-VP3、5、7基因的克隆构建及序列分析
• 2.2 重组质粒表达产物的SDS-PAGE分析鉴定
• 2.3 重组质粒表达产物的Western blot分析鉴定
• 2.4 VP5重组蛋白间接ELISA方法检测的结果
• 3 讨论
• 第四章 小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及表达产物的免疫原性鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 PPRV-H基因的克隆构建及序列分析
• 2.2 重组质粒表达产物的SDS-PAGE分析鉴定
• 2.3 重组质粒表达产物的Western blot分析鉴定
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录