67LR促进肝癌侵袭转移的分子机制研究

论文摘要

目的:层粘连蛋白是细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重要的成分之一。67 kD层粘连蛋白受体（67 kD laminin receptor , 67LR）是层粘连蛋白的一个非整合素受体,与层粘连蛋白相互作用,调节肿瘤的增殖、粘附、血管形成,促进肿瘤的侵袭转移。本实验室前期发现67LR的高表达可以促进肝癌细胞的侵袭能力,本研究旨在探讨67LR对转移相关基因表达的影响,以阐明67LR促进肝癌侵袭转移的分子机制。方法:采用瞬时转染以及构建稳定细胞株来实现67LR的高表达,采用RNA干扰技术降低67LR的表达,抑制效果采用流式细胞术和半定量RT-PCR检测;运用半定量RT-PCR技术分析67LR对基因表达的影响,部分基因表达的变化通过荧光定量PCR验证;MMPs活性的变化通过明胶酶谱测定。结果:67LR高表达的稳定细胞株LR4,其MMP-2、MMP-9的表达比67LR低表达的LR6及对照组pcDNA-1细胞明显升高,明胶酶谱分析也揭示,LR4细胞分泌的MMP-2和MMP-9的活性明显上升;瞬时转染67LR重组质粒的Huh-7细胞,其MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-4、Hpa、uPA、Cath- B及Cath-D的表达明显升高,而TIMP-2、TIMP-3的表达明显下降;在SMMC-7721细胞和Huh-7细胞中,67LR表达的下调可以抑制MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-4、Hpa、uPA、Cath-B、Cath-D等基因的表达,而促进TIMP-2、TIMP-3的表达。结论:67LR可以通过调节MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-4、Hpa、uPA、Cath-B、Cath-D、TIMP-2、TIMP-3等多个基因的表达,从而促进肝癌的体外侵袭能力。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一章 67LR 促进肝癌细胞MMP-2 和MMP-9 的表达
• 一、材料与方法
• 1.1.1 细胞培养
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 细胞总RNA 提取
• 1.1.4 半定量 RT-PCR 扩增 MMPs 及 TIMPs
• 1.1.5 Real Time-荧光定量 PCR
• 1.1.6 明胶酶谱法分析检测 MMP-2 及 MMP-9 的表达及活性
• 1.1.7 统计学分析
• 二、结果
• 1.2.1 HepG2 细胞MMPs 和TIMPs 的总体表达
• 1.2.2 67LR 促进HepG2 细胞 MMP-2 和MMP-9 的表达
• 1.2.3 67LR 促进MMP-2 和MMP-9 的活性
• 三、讨论
• 四、小结
• 第二章 67LR 瞬时转染对转移相关基因表达的影响
• 一、材料与方法
• 2.1.1 细胞培养
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 质粒抽提
• 2.1.4 引物设计
• 2.1.5 质粒转染
• 2.1.6 半定量 RT-PCR
• 2.1.7 统计学方法
• 二、结果
• 2.2.1 67LR 对MMPs 表达的影响
• 2.2.2 67LR 对 TIMPs 表达的影响
• 2.2.3 67LR 对其他转移相关基因表达的影响
• 三、讨论
• 四、小结
• 第三章 67LR knock-down 对转移相关基因表达的影响
• 一、材料与方法
• 3.1.1 细胞培养
• 3.1.2 siRNA 设计及合成
• 3.1.3 siRNA 转染
• 3.1.4 流式细胞术检测
• 3.1.5 半定量RT-PCR
• 3.1.6 统计学分析
• 二、结果
• 3.2.1 67LR RNAi 效果鉴定
• 3.2.2 67LR knock-down 对MMPs 表达的影响
• 3.2.3 67LR knock-down 对TIMPs 表达的影响
• 3.2.4 67LR knock-down 对其他转移相关基因表达的影响
• 三、讨论
• 四、小结
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 在读期间发表论文
• 致谢