晚期糖基化终产物修饰蛋白质诱导人胚胎肝细胞产生C反应蛋白及其作用机制研究

论文摘要

研究背景 心血管疾病（Cardiovascular Diseases，CVD）是慢性肾脏疾病（Chronic Kidney Disease，CKD）患者死亡的主要原因。CKD患者动脉粥样硬化的发生率较正常或无慢性肾脏疾病的人群高10～20倍，且发病年龄明显提前，被称之为“加速性动脉粥样硬化”。但CKD患者心血管疾病发病率明显增高的原因目前尚未完全明了，其中近年备受关注的是CKD患者中存在的“微炎症状态”。大量证据表明，CKD患者普遍存在着持续低度的全身炎症反应，表现为循环中存在着高水平的促炎症细胞因子及其拮抗物，以及血清急性时相反应物质如C-反应蛋白（C-Reactive Protein，CRP）等。其中CRP是近10余年来的研究热点。 CRP属于五聚体蛋白家族成员之一，在机体感染、炎症、创伤、恶性肿瘤等情况下其血清浓度迅速增高。对于CKD患者，近年众多临床研究证实，CRP增高的程度与慢性肾功能衰竭（Chronic Renal Failure，CRF）心血管事件的发生密切相关，在矫正了其他变量后，只有CRP和年龄（而非其它危险因素）是血透病人心血管死亡率的预测因子。目前多数学者认为，血清CRP水平是预测CKD患者心血管病变相对危险性和死亡率的最有价值的指标。 但是，CKD患者发生微炎症状态和CRP增高的原因尚不清楚。以往研究提出了“感染学说”、“透析相关学说”和“内毒素学说”。但由于CKD患者并非都并发有持续感染，没有接触血透膜的腹透病人循环CRP水平同样增高，且CKD患者循环的内毒素水平与CRP水平也无恒定的相关关系，因此这些研究结果提示，感染、内毒素和血透相关因素并不是CKD时CRP水平增高和发生微炎症状态的唯一原因，可能还有一些与CKD本身有关的因素参与了微炎症的发生并导致CRP增高。既往研究表明肝细胞合成CRP主要受促炎症细胞因子IL-6调节。然而，CKD时的

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 人胚胎肝细胞的分离、纯化、鉴定和培养体系的建立
• 第一章 引言
• 第二章 材料和方法
• 1.2.1 主要试剂及仪器
• 1.2.2 主要试剂配制
• 1.2.3 人原代胚胎肝细胞的分离
• 1.2.4 人原代胚胎肝细胞的纯化
• 1.2.5 人原代胚胎肝细胞的培养
• 1.2.6 人原代胚胎肝细胞的鉴定
• 第三章 结果
• 1.3.1 人原代胚胎肝细胞的分离
• 1.3.2 人原代胚胎肝细胞的纯化
• 1.3.3 人原代胚胎肝细胞的培养
• 1.3.4 人原代胚胎肝细胞的鉴定
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 第六章 参考文献
• 第二部分 AGEs修饰蛋白对人胚胎肝细胞合成CRP的影响及作用机制
• 第一章 材料和方法
• 2.1.1 主要试剂及仪器
• 2.1.2.主要试剂配制
• 2.1.3 无内毒素AGEs修饰蛋白的制备和鉴定
• 2.1.4 人胚胎肝细胞的分离、纯化和培养
• 2.1.5 ELISA法检测不同处理因素的人胚胎肝细胞培养上清中CRP浓度
• 2.1.5.1 ELISA法检测AGEs-HSA作用的人胚胎肝细胞培养上清中CRP浓度
• 2.1.5.2 ELISA法检测单核细胞条件上清作用的人胚胎肝细胞上清中CRP浓度
• 2.1.5.3 细胞因子中和性抗体及其可溶性受体对单核细胞条件上清诱导人胚胎肝细胞产生CRP的影响
• 2.1.5.4 单核细胞条件上清与外源性细胞因子对人胚胎肝细胞CRP诱导作用的比较
• ? Green Ⅰ嵌合荧光法检测单核细胞条件上清诱导的人胚胎肝细胞内CRP mRNA表达水平'>2.1.6 实时荧光定量RT-PCR-SYBR^? Green Ⅰ嵌合荧光法检测单核细胞条件上清诱导的人胚胎肝细胞内CRP mRNA表达水平
• 2.1.6.1 人胚胎肝细胞的培养
• 2.1.6.2 人胚胎肝细胞的处理
• 2.1.6.3 人胚胎肝细胞总RNA的提取
• ? Green Ⅰ嵌合荧光法检测单核细胞条件上清诱导的人胚胎肝细胞内CRP mRNA水平'>2.1.6.4 应用实时荧光定量RT-PCR—SYBR^? Green Ⅰ嵌合荧光法检测单核细胞条件上清诱导的人胚胎肝细胞内CRP mRNA水平
• 2.1.7 统计学处理
• 第二章 结果
• 2.1.1 无内毒素AGEs修饰蛋白的鉴定
• 2.2.2 ELISA法检测AGEs-HSA对人胚胎肝细胞产生CRP的直接诱导作用
• 2.2.3 ELISA法检测单核细胞条件上清对人胚胎肝细胞CRP的诱导作用
• 2.2.3.1 单核细胞条件上清对人胚胎肝细胞CRP诱导作用的时间效应
• 2.2.3.2 单核细胞条件上清对人胚胎肝细胞CRP诱导作用的剂量效应
• 2.2.3.3 细胞因子中和性抗体及其可溶性受体对单核细胞条件上清诱导人胚胎肝细胞产生CRP的抑制作用
• 2.2.4 单核细胞条件上清与外源性细胞因子对人胚胎肝细胞CRP诱导作用的比较
• 2.2.4.1 ELISA法检测AGEs-HSA处理的单核细胞上清中IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度
• 2.2.4.2 单核细胞条件上清与外源性细胞因子对人胚胎肝细胞CRP诱导作用的比较
• 2.2.5 单核细胞条件上清对人胚胎肝细胞CRP mRNA表达水平的影响
• 2.2.5.1 构建相对定量标准曲线
• 2.2.5.2 实验数据的标准化
• 2.2.5.3 单核细胞条件上清对人胚胎肝细胞CRP mRNA诱导作用
• 第三章 分析和讨论
• 第四章 结论
• 第五章 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
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