中国柑橘黄龙病病原及分化研究

论文摘要

柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing, HLB）是世界柑橘生产上为害极为严重的一种毁灭性病害,主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的40多个国家和地区;黄龙病能侵染各种柑橘类植物,病树主要表现为斑驳型黄化、均匀型黄化、缺素型黄化和“红鼻子”果等症状,造成植株经济寿命减短,产量降低,果品质劣失去经济价值,从而引起巨大的经济损失,据不完全统计,仅在2004-2007年,巴西圣保罗州有200万株病树被砍除。在我国的广东、广西和福建等地,也有超过4000多万株柑橘因感染黄龙病被砍除。黄龙病的病原物尚不能人工培养,目前普遍认为原核生物薄壁菌门变形菌纲（Proteobacteria）α-变型菌纲（Alphaproteobacteriacea）根瘤菌目（Rhizobiales）根瘤菌科（Rhizobiaceae）韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter）是引起黄龙病的主要病原。柑橘黄龙病尚无特效治疗性药剂,也没有抗（耐）病品种可供应用。因此,严格的检疫措施、使用无病苗木、及时挖除病树,以及系统、全面的防治木虱是目前防治黄龙病最有效的方法。为了更好地对黄龙病病原及其分化进行研究,本研究运用PCR技术对从中国广西、广东、云南、江西、福建、湖南和四川7省的23个市采集的359个黄龙病疑似样品进行了黄龙病韧皮部杆菌（Ca.Liberibacter）和植原体的检测。比较了斑驳型黄化、“红鼻子”果、均匀型黄化、缺素型黄化以及无症状样品中黄龙病病原感染情况；同时,运用7种限制性内切酶对黄龙病亚洲种的omp基因进行PCR-RFLP和序列分析,以期明确我国黄龙病病原种类,从而了解亚洲种种内分化情况,为黄龙病的起源提供分子依据。主要研究结果：1、在359个黄龙病疑似样品中,237个样品检测到黄龙病,检出率为60.02%,且全为黄龙病亚洲种（Ca. Liberibacter asiaticus）;此外,有18个黄龙病疑似样品感染了植原体,检出率为5.01%,有7个样品混合感染了HLB亚洲种和植原体。2、结合症状分析,在感染黄龙病亚洲种的237个柑橘样品中,表现斑驳症状的样品有173个（占总数的73%）;表现“红鼻子”果的样品有30个（占总数的13%）；表现均匀型黄化的样品有19个（占总数的8%）；表现缺素型黄化症状的样品有10个（4%）,无症状的样品有5个（2%）。同时,在感染植原体的18个柑橘样品中,表现均匀型黄化的样品有11个（占总数的61%）；表现缺素型黄化的样品有7个（占总数的39%）；未发现表现斑驳型黄化和“红鼻子”果的柑橘样品感染了植原体,由此推测植原体与黄龙病的相关性不明显,还有待进一步研究。3、将检测到的18个植原体的16S rDNA通过T-A克隆测序分析表明,18个植原体均属于翠绿黄化组（Ca. Phytoplasma asteri）。4、对7个不同省区的表现不同症状的黄龙病亚洲种进行了种内分化研究,通过建立的omp基因的扩增体系,运用TaqI、BclI、ApoI、MssI、SmiI、SspI和EcoRI等7种限制性内切酶对omp基因进行了PCR-RFLP多态性分析,结果表明,上述内切酶在黄龙病分离株的omp基因上具有酶切位点,其中,ApoI和TaqI酶产生的多态性最好。通过RFLP的分析能将23个分离株区分成6不同的进化组,呈斑驳型黄化的样品的多态性最复杂,而呈黄化型症状的样品多态性较为单一。5、通过序列分析表明,本研究的表现不同症状、不同品种的23个黄龙病亚洲种的omp基因与亚洲种Poona株系（AY642159）和非洲种Nelspruit株系（AY642158）的同源性分别为99.3-99.6%和72.4%-72.7%；同时,本研究的23个有代表性的黄龙病样品的omp基因核酸序列间的最大相似性为99.3%-99.9%。通过进化树分析,所有的亚洲株系都聚在一起,与非洲株系分开；同时,所有的亚洲株系又分为3个亚组：HN-ay和GX-nfmj为第一亚组,Indonesian（AB480132）, Vietnamese（AB480111）, Nepal （AY842430）, India（AY642159）和SC-qc为第二亚组,其他为第三亚组。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词与中英文对照
• 第1章 文献综述
• 1.1 黄龙病的危害与分布
• 1.1.1 黄龙病的危害
• 1.1.2 黄龙病的分布
• 1.2 病原研究
• 1.2.1 病原的认识历程
• 1.2.2 分离培养
• 1.2.3 病原分化
• 1.3 黄龙病寄主与症状
• 1.3.1 寄主
• 1.3.2 症状
• 1.4 致病机理
• 1.5 传播途径与病害流行
• 1.5.1 传播途径
• 1.5.2 流行与蔓延
• 1.6 诊断与检测鉴定技术
• 1.6.1 田间诊断
• 1.6.2 实验室鉴定
• 1.7 防控
• 1.7.1 防控策略
• 1.7.2 防控技术研究
• 1.7.3 防控措施
• 1.8 展望
• 第2章 引言
• 第3章 我国黄龙病病原研究
• 3.1 实验器材
• 3.1.1 供试毒源、植株
• 3.1.2 主要化学试剂
• 3.1.3 常用储备液及缓冲液
• 3.1.4 主要实验仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 总核酸提取
• 3.2.2 黄龙病韧皮部杆菌检测体系
• 3.2.3 相关植原体检测体系的建立
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 柑橘样品中黄龙病韧皮杆菌的种类检测
• 3.3.2 相关植原体检测、鉴定
• 第4章 黄龙病OMP基因的PCR-RFLP及其序列分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 主要化学试剂
• 4.1.3 常用储备液及缓冲液
• 4.1.4 主要实验仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 omp基因的PCR扩增
• 4.2.2 omp基因的RFLP分析
• 4.2.3 PCR产物的纯化、回收
• 4.2.4 目的DNA片段的连接、转化和克隆子鉴定
• 4.2.5 亚洲种omp基因的序列分析
• 4.3 试验结果与分析
• 4.3.1 omp基因的扩增
• 4.3.2 omp基因RFLP分析
• 4.3.3 omp基因的系统进化分析
• 第5章 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 病原种类研究
• 5.2.2 病原分化研究
• 参考文献
• 致谢
• 附表
• 攻读学位期间发表论文及参加科研项目