肝癌细胞QY及其细小病毒H1抗性细胞克隆QYRC基因表达差异的研究

论文摘要

自主性细小病毒H1（Autonomous Parvovirus H1,PV H1）是一类无囊膜,裂解性的DNA病毒。众多研究表明PV H1对各种类型的肿瘤,不同诱因（DNA和RNA肿瘤病毒,化学致癌剂等）诱发的人和动物（鼠,犬）的肿瘤均有抑制作用。此外PV H1还可以使肿瘤细胞和转化细胞发生“逆转”,而对正常细胞无作用。已有研究表明,肿瘤细胞和正常细胞对PV H1的敏感性差异来自于肿瘤细胞与正常细胞基因表达的不同。虽然前人的研究已识别了不少细小病毒杀伤肿瘤细胞作用相关的基因,但具体哪些基因参与了这个过程,作用机理如何,还有待研究。肝癌是中国和南亚地区最常见的癌症之一。对肝癌细胞株QGY-7703和细小病毒H1相互关系的研究已比较深入。为了了解细小病毒抗性细胞株和敏感性细胞株在基因表达水平上的差异,本实验以QGY-7703作为亲本细胞株,通过细小病毒作用,得到一对“对子（细小病毒抗性和敏感性）细胞”,再采用基因芯片与荧光定量PCR相结合的方法研究其基因表达谱的差异。通过比较细小病毒抗性和敏感性细胞间基因表达的变化,希望找到与细小病毒作用相关,或与肿瘤发生相关的基因,为肿瘤的研究和治疗寻找新的思路和标靶。本实验所用的“对子细胞”以QGY-7703细胞株为亲本细胞,经过软琼脂克隆形成后挑选出一个同一性较亲本细胞高的细胞克隆（QY）,该细胞为PV H1敏感性,然后将QY细胞用PV H1反复筛选最后得到一株稳定的PV H1抗性克隆（QYRC）。从细胞学和病毒学角度对这一对“对子细胞”进行生物学鉴定,验证其在恶性程度方面的差异。然后采用代表了38,500个人类基因的寡聚核苷酸芯片（Genechip Human Genome U133 plus 2.0,Affymetrix）进行基因表达谱差异的研究,再挑选出表达变化显著的基因采用SYBR Green荧光定量PCR法从细胞水平和临床组织学水平对芯片结果进行验证。最后结合NCBI检索分析,筛选得到了一些可能与肿瘤发生相关的基因细胞生物学实验通过细胞形态观察,细胞周期测定,细胞染色体计数,软琼脂克隆实验,病毒感染后细胞存活率测定和裸鼠成瘤一系列试验,发现PV H1抗性细胞株QYRC的细胞形态和染色体数目更接近正常细胞,软琼脂成克隆率很低,病毒感染后细胞存活率高,且细胞注射裸鼠不成瘤,而相应PV H1敏感性的QY及QGY-7703细胞则属于恶性癌细胞。以上结果都说明PV H1抗性细胞株QYRC恶性程度减轻,更接近于正常细胞,与PV H1敏感性的恶性肝癌细胞株QY及QGY-7703差别很大。随后的芯片结果表明,PV H1抗性与PV H1敏感性细胞相比（QYRC vs.QY）,大量基因表达量增多,且数量及变化幅度均大于表达量减少的基因;综合之前另两对“对子细胞”（PV H1抗性细胞株vs.PVH1敏感性细胞株）的芯片结果（L02C3RCR50 vs.1.02;L02C3RC1 vs.L02C3）,得到在PV H1抗性细胞中共同表达量增加,且变化显著（SLR=1）的基因19个;共同表达量减少,且变化显著（SLR=1）的基因1个。再从芯片结果中选择了16个基因表达水平变化显著的基因通过荧光定量PCR实验验证了这些基因在PV H-1抗性细胞QYRC与敏感性细胞QY间（QYRC vs.QY）的表达差异,并进一步在肝癌组织块及癌旁组织块中（癌旁组织vs.肝癌组织）,通过荧光定量PCR验证了这些基因的表达差异。综上,芯片和荧光定量PCR的结果一方面提示PV H1抗性（实验组）比PV H1敏感性（对照组）细胞的基因表达整体上调。这些基因的表达变化与很多信号通路和生物学过程有关。其中与信号转导、转录调控,细胞黏附、细胞迁移,炎症反应和补体反应等相关的占很大比例;另一方面,帮助我们筛选到了一些正常细胞相对癌转化细胞表达变化显著的基因,结合NCBI对这些基因功能的检索分析,发现他们很可能与细小病毒H1特异性杀伤肿瘤细胞的作用机理以及肿瘤的发生,转移密切相关。目前我们已从这些候选基因中选择出了一些基因,打算通过一系列更加深入的实验,研究他们在肝癌形成,癌症发生或肿瘤“逆转”中的具体生物学功能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 肝癌细胞株QY及其PV H1抗性细胞株QYRC的生物学鉴定
• 1 实验材料与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂和仪器
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 仪器
• 1.2.3 常用试剂配制
• 2 实验方法
• 2.1 细胞复苏
• 2.2 细胞冻存
• 2.3 细胞形态观察
• 2.4 细胞周期测定
• 2.5 染色体计数
• 2.6 软琼脂克隆实验
• 2.7 PV H-1感染后细胞存活率测定
• 2.7.1 预试验
• 2.7.2 实验测定
• 2.8 裸鼠成瘤
• 3 实验结果
• 3.1 细胞形态和生长状况
• 3.2 细胞周期测定
• 3.3 染色体计数
• 3.4 软琼脂克隆实验
• 3.5 PV H-1感染后细胞存活率
• 3.5.1 预试验
• 3.5.2 实验结果
• 3.6 裸鼠成瘤
• 4 讨论
• 第二章 肝癌细胞QY及其PV H1抗性细胞QYRC基因表达差异研究
• 1 实验材料与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂和仪器
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 仪器
• 1.3 相关软件及数据库
• 2 实验方法
• 2.1 cDNA芯片实验
• 2.1.1 总RNA的提取和鉴定
• 2.1.2 cDNA的合成和纯化
• 2.1.3 cRNA的合成和纯化
• 2.1.4 cRNA片断化和制备杂交液
• 2.1.5 芯片杂交和洗脱
• 2.1.6 扫描芯片和数据分析
• 2.2 荧光定量PCR
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 反转录
• 2.2.3 SYBR荧光定量PCR
• 2.2.4 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 芯片实验
• 3.1.1 芯片杂交实验的质量控制
• 3.1.2 芯片结果分析
• 3.2 荧光定量PCR实验
• 4 讨论
• 4.1 从结果中得到的启示
• 4.2 实验研究方法的讨论
• 4.3 下一步工作展望
• 小结
• 参考文献
• 论文发表情况
• 附录
• 致谢