猪胸膜肺炎放线杆菌外毒素apxⅡA基因的原核表达以及ApxⅡA单克隆抗体的研制和APP复合PCR检测方法的建立

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一种高度接触传染性呼吸道疾病[1],该病给集约化养猪业造成严重的经济损失。APP的胸膜肺炎放线杆菌毒素（Actinobacillus pleuropneumoniae toxin,Apx）是其主要的毒力因子,APP至少能产生4种不同的Apx外毒素,即ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV[2],目前己分离鉴定了15种血清型APP的Apx,其毒力因子非常复杂,型间交叉免疫保护率低,因而该病的诊断与防制相当困难。己证实了ApxI、ApxII与ApxIII的溶血活性及对巨噬细胞与嗜中性粒细胞的毒性作用,且ApxIII被证实有诱导细胞凋亡的活性,而ApxIV仅具有微弱的溶血活性,其它作用尚不清楚[3]。敏感、特异的诊断方法将有利于猪传染性胸膜肺炎的控制。已知ApxII存在于除10型以外所有血清型中,且具有种特异性,适合用于建立可以普查APP的诊断方法。为给APP外毒素作用机制的研究及其诊断方法的建立提供单克隆抗体这一有用工具,我们开展了以下工作:1.apxIIA基因的克隆与及其在大肠杆菌中的表达依据GenBank中公布的apxIIA基因序列,利用引物设计软件合成特异性引物,扩增了所需片断,连接到pCR2.1载体中,获得重组质粒pCR-apxIIA,并进行了测序;确认正确后将片断双酶切并克隆到表达载体pGEX-6P-1的启动子下游,构建了重组原核表达质粒pGEX-apxIIA,转化E.coli DE3,测序无误后经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白的分子量约为130kD,命名为rApxIIA,表达产物主要以包涵体形式存在,Western-blot证实表达产物具有良好的抗体结合特性。2.天然外毒素的制备及纯化从现有的APP 1型标准株可以获得ApxI、ApxII这两种外毒素的混合物,在TSB培养基中加入适宜的辅酶I （NAD）以及钙离子后,培养细菌过夜,离心后取上清,利用饱和硫酸铵沉淀法沉淀,用PBS重悬沉淀,透析3天后进行鉴定,SDS-PAGE和Western-blot结果表明获得所需毒素。3.外毒素ApxIIA单克隆抗体的制备用提取的天然毒素作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后用重组蛋白rApxIIA包被的酶标板通过间接ELISA检测,得到两株阳性杂交瘤细胞,能稳定分泌单克隆抗体,分别命名为3A11、8B3。对空载体表达产物、致病性大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌的平行测定表明:两株单克隆抗体的特异性良好。用小鼠腹水生产的上述2株单克隆抗体的ELISA效价分别为51200、102400,单克隆抗体3A11属于IgG1亚类,8B3属于IgG2a亚类。4.APP复合PCR方法检测方法的建立根据GenBank中已发表的序列,分别设计针对APP cpx基因和apxIV基因的特异性引物,建立针对APP的多重PCR方法,可在一次PCR反应中扩增出相应的389bp和498bp的目的片段。应用这个多重PCR方法,对来自江苏地区的97份疑似病料进行检测,实验结果表明这个多重PCR方法具有一定的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一章 胸膜肺炎放线杆菌外毒素apxIIA 基因的克隆、测序及原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二章 抗胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxII 单克隆抗体的研制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 APP复合PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 致谢